生物傳感器系將生物敏感物質轉換檢測方便的信號的器件[1]，主要包括靶標識別元件和信號轉換元件. 靶標識別元件是構建生物傳感器的關鍵，必須對靶標有特異性與專一吸附或反應. 根據靶標識別元件的不同，生物傳感器可分為酶傳感器、免疫傳感器、DNA 傳感器等[2]. 信號轉換元件是生物傳感器的重要組成部分， 它對傳感器的信號收集、運用、靈敏度等有極大的影響. 根據檢測手段的不同，又分為質量敏感型、熱敏型、場效應型、光學、電化學等傳感器[3].
DNA 電化學生物傳感器以 DNA 為靶標識別元件，以電化學方法為檢測手段[4]，具有以下優點：
1）DNA 可人工合成，成本低，易于保存；2）對檢測對象，不僅可根據堿基互補配對的原則，檢測特定序列的 DNA，還可利用適配體的特點，檢測離子、小分子、多肽、蛋白質甚至細胞；3）用量少，易微型化；4）可聯用多種檢測方式，如質量型、光學、電化學等. 其中電化學傳感器由于選擇性好、靈敏度高、成本低、操作簡便和易于微型化等而備受關注[5].
酶是指具有生物催化功能的生物大分子，其催化效率很高， 對底物專一性好. 酶 DNA 電化學傳感器響應快、操作簡單，近年發展尤為迅速. 本文結合作者課題組的研究工作介紹酶放大 DNA電化學傳感器的進展.
1 蛋白質酶 （ 聚合酶 、 連接酶 、 內切酶、外切酶）
脫氧核糖核酸 （DNA） 是生物遺傳信息的載體， 其結構和功能對生物的遺傳和變異有重要意義. 1953 年，Watson 和 Crick 提出了 DNA 的反向雙螺旋結構，其兩條 DNA 鏈對應的堿基 A-T 以雙鍵形式連接，C-G 以三鍵形式連接， 糖-磷酸-糖主鏈在螺旋外側， 配對堿基在螺旋內側. 利用 DNA鏈之間堿基互補配對原則， 可實現特定序列的DNA 檢測.
聚合酶、連接酶、內切酶、外切酶等蛋白質酶對 DNA 底物有較好的特異性和高效的催化. 利用酶與 DNA 的作用設計的 DNA 電化學傳感器已展現出強大的優越性和研究活力[6]. 通過聚合酶反應的放大作用[7]，實現了目標物 （OTA）的超靈敏檢測， 檢測限達 6.5×10-11g·L-1. 利用 T4 連接酶將模板 DNA 首尾相接閉合成環并與引物 DNA 相結合，在 DNA 聚合酶的作用下，其引物可沿著環形模板不斷擴增，達到滾環放大（RCA）形成多拷貝新鏈 DNA. 該 DNA 與通過 Au—S 鍵固定到金電極上的固定探針 DNA 雜交，從而可吸附更多電化學活性物質亞甲基藍（MB）.
單一酶放大方法已可得到令人滿意的檢測效果， 通過有機耦合兩種酶放大反應可得到更低的檢測限. 鞠熀先課題組通過聯用內切酶和聚合酶，實現了特定序列 DNA 的超靈敏檢測（1.1×10-17mol·L-1）[8].
他們將生物素標記的捕獲 cDNA 固定于親和素修飾電極. 在目標 tDNA 存在下，與輔助 aDNA 及 cDNA堿基互補雜交，形成了內切酶活性位點，通過內切酶的作用使目標 tDNA 循環利用， 導致了大量的RCA 引物序列的暴露.又經 RCA 反應形成的長鏈DNA 與量子點標記的探針 DNA 雜交， 實現了對目標 tDNA 的靈敏檢測. 通常， 聚合酶和內切酶對DNA 的活性位點只針對某一序列， 這給設計通用型 DNA 電化學傳感器增添了難度，在一定程度限制了其運用[9]. 外切酶可從核酸一端開始按序列順序催化水解核酸磷脂鍵，對 DNA 序列無特定要求[10-11]. 2010 年，Plaxco 小組率先提出了利用外切酶III（Exo III）實現目標物循環放大的檢測方法[12]. 隨后報道用 Exo III 酶在電極上反應的靈敏檢測各種物質，如 DNA[13-15]、離子（Hg2+）[10]、蛋白質[16]等. 作者課題組報道了 Exo III 酶放大的免標記通用型檢測tDNA 方法[11]. 如圖 1 所示，將形成突出 3′端的雙鏈 DNA 探針通過 Au—S 鍵固定于金電極上，當tDNA 與雙鏈 DNA 探針雜交時就可得到 Exo III活性位點（鈍的 3′端雙鏈），釋放出的 tDNA 又可進行下一輪剪切，最終使含游離鳥嘌呤堿基（G）的探針被大量剪切, 使其減弱對電化學活性物質亞甲基藍（MB）的吸附，實現 tDNA 的靈敏檢測. 此法利用游離的 G 和 MB 的強烈特異作用， 免去了對探針的修飾，提高了靈敏度且降低了檢測成本.
2 酶聯催化反應（辣根過氧化物酶）
聚合酶、內切酶、外切酶等顯示出強大信號放大能力，其作用底物為 DNA，通常需對 DNA 進行電化學活性物質的標記 （如二茂鐵和亞甲基藍）.
在分析過程中， 通過構型改變導致電化學活性物質與電極距離變化， 從而其電信號改變就可檢測目標物. 但這種構型變化引發的電化學信號較弱，其應用受限. 酶聯免疫分析法利用抗體、抗原的特異性結合酶催化作用， 實現蛋白質分析檢測[17-18].
該方法在核酸分析領域已引發關注[19-20].
辣根過氧化物酶（HRP）系常用的標記蛋白質或 DNA 酶， 可催化氧化 3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺（TMB）形成藍色氧化物，已廣泛應用于比色傳感領域[21]. 樊春海課題組[22]利用 HRP 具有催化氧化 TMB 的性能結合電化學的優勢得到了 DNA的 fmol·L-1級別檢測限. 他們將修飾 Biotin 和 Dig的分子信標（MB）固定于 Avidin 電極. 這種分子信標的結構阻礙了 Dig 與 Antidig-HRP 的結合. 當目標 tDNA 打開分子信標時，同時造成分子構型的改變， 促使暴露的 Dig 與 Antidig-HRP 結合， 得到HRP 氧化的 TMBOX的還原電流. 這種方法需分子信標修飾，增加了體系的復雜性和成本.作者課題組報道了用免標記的功能型分子信標檢測特定序列的 tDNA[23]. 圖 2 設計了含 SA 適配體序列的分子信標探針， 其位阻效應阻礙了適配體與 SA 的結合. 當目標物 tDNA 與探針相結合時，使適配體序列暴露于溶液中形成可與 SA-HRP緊密接觸的結構，并測得 TMBOX還原電流，檢測達到 pmol·L-1級別的 tDNA. 利用 SA 適配體與 SA的作用，可免去探針繁瑣修飾，降低成本，取得優異的檢測效果.
3 脫氧核酶（8-17 DNA 酶）
傳統觀點認為所有的酶均系蛋白質. 20 世紀80 年 代 初 ，Cech 和 Altman 發 現 了 核 酶 （Ri-bozyme）改變了這一看法[24], 隨之人工合成篩選了有 RNA 切割和連接可催化形成肽鍵、磷酸化等能力的核酶. Breaker 小組也發現有同樣催化能力的DNA 片段，即脫氧核酶 （DNA 酶 ）[25]. 這一重大的發現為核酸分析領域提供了重要思路， 許多 DNA酶的檢測方法已有報道.
在 DNA 酶的催化反應， 常需金屬離子作為輔酶因子. 因此，DNA 酶的生物傳感器常用于金屬離子的檢測. 目前，已報道 Pb2+[26]、Hg2+[27]、Cu2+[28]、Mg2+[29]等作為輔酶因子的 DNA 酶. Pb2+作為 8-17 DNA酶的輔酶， 可激發酶的活性并能將一定結構的互1分析[30]. 在 Pb2+的存在下，8-17 DNA 酶活性被激發，切割其互補鏈，使修飾于 DNA 鏈兩端的熒光基團和猝滅基團分離，實現了 Pb2+檢測. Xiao 等[31]將 8-17 DNA 酶末端修飾電化學活性的亞甲基藍并固定于電極上， 通過 Pb2+激發酶活性從而得到電流信號. 作者課題組報道了將 8-17 DNA 酶通過電化學發光（ECL）檢測 Pb2+ [32]. 圖 3 將氨基修飾的具有酶活性的 DNA 探針固定于活化羧基的玻碳基底， 加入功能核酸的底物 DNA 后， 在輔酶 Pb2+的作用下，8-17 DNA 酶將底物 DNA 切斷， 使該8-17 DNA 酶通過堿基互補原則與修飾發光材料（Ru）的分子信標雜交，得到發光信號. 這種方法充分利用了 8-17 DNA 酶對底物 Pb2+的特異選擇和堿基互補配對的原則, 實現了 Pb2+靈敏特異檢測.
過氧化物酶活性的 DNA 酶在生物分析領域的運用越來越受重視[33-35]. 這類 DNA 酶對核酸序列的要求不高， 一般能形成 G-四分體結構的均能與血紅素（Hemin）相作用構成 DNA 酶. G-四分體結構的 DNA 酶有類似于辣根過氧化物酶活性，在H2O2存在下可使魯米諾（Luminol）催化發光[36]，也可 以 使 2,2′-連 氮-雙 \\(3-乙 基 苯 并 噻 哩-6-磺 酸\\)（ABTS）[37-38]顯色，已被廣泛運用于比色傳感器領域. Liu 等[13]將 G-四分體結構的 DNA 固定于電極，由于互補鏈 DNA 以其雜交屏蔽了其活性， 當目標在 tDNA 和 Exo III 的作用下，使其恢復催化活性，體現雙酶的優勢，實現 tDNA fmol·L-1級別的檢測.
4 DNA 電化學生物傳感器的常見問題與解決方案
國內外研究者一直致力于發展 DNA 電化學生物傳感器，結合酶放大方法實現超靈敏、特異的目標物檢測，已取得了很好的進展. 目前該方法存在的主要問題：1）電極選擇：主要有玻碳電極和金電極. 玻碳電極需要較為復雜的預處理， 固定探針時其露出的羧基與修飾了氨基的探針需經較長時間的孵化[32]. 金電極主要是通過自組裝，利用 Au—S鍵將探針固定于金電極上[11, 23]；2）固定探針的濃度：
不同的體系， 固定于電極上的探針濃度會極大地影響分析效果，濃度過高造成較大的排斥，降低其與目標物的接觸效率，濃度太低則信號較弱. 目前主要根據不同體系經優化選取最佳的信噪比[10, 39]；3）非特異性吸附：固定探針的同時需防止探針的非特異性吸附， 常用巰基己醇或氨基己醇. 在酶反應的過程中，金電極與酶吸附所造成的背景信號極大地影響其分析效果，通?？捎?BSA 封閉金電極[23]；4）雜交效率：非均相反應會不同程度地影響分析效果. Wang 課題組提出了三元單層結構組成的電化學傳感界面，其中巰基己醇（MCH）使固定于電極表面 DNA 探針可直立于電極表面從而得到統一的構型，有利于雜交. 二硫蘇糖醇（DTT）通過兩個巰基固定于電極上， 其兩個親水羥基使 DNA 雜交傳感器的雜交效率更高，分析效果更好[40-41].
5 DNA 電化學傳感器的發展趨勢
比表面積和導電效果均是影響電化學傳感器分析效果的重要因素. 碳納米管、石墨烯、金屬納米粒子等的修飾，結合 DNA 的識別作用越來越受到關注[42-43]. 納米磁珠的富集能極大地提高信號 ，已被廣泛報道[5]. 免標記的電化學方法簡單、快速、方便，已受到極大的重視, 特異性好、靈敏度高的免標記 DNA 電化學生物傳感器是今后的研究方向. 對此，作者在研究免標記 ATP 檢測方面進行了一些嘗試[44]，研究結果進一步證明了免標記電化學檢測的特點和應用潛力. 然而，DNA 電化學生物傳感器常需將識別探針固定于電極上， 這種非均相反應使分析體系受到一定限制， 如固定探針過程繁瑣、雜交效率低與非特異性吸附. 發展均相反應的 DNA 電化學傳感器正日益受到重視.
