1 引 言
藥物代謝和藥代動力學\\( DMPK\\) 定量描繪藥物及其它外源性物質經過各種途徑進入機體后的吸收、分布、代謝、排泄過程及其機制,闡釋機體對藥物的處置、揭示藥物在體內的生物轉化以及與內源性和外源性物質的相互作用,為新藥研發和臨床安全、有效和合理用藥提供科學依據。生物樣品中藥物及其代謝產物的定性與定量分析,是藥物代謝研究的關鍵環節,復雜生物基質中低濃度藥物和代謝產物的檢測、定量分析和結構鑒定常是一個挑戰性工作[1]。同時,在疾病發現和診斷、藥物對機體的藥效學研究、臨床用藥監測以及濫用藥物和毒物的中毒分析中,也涉及大量的體內生物樣品的分析,其對象包括血漿、血清、尿、唾液、膽汁等各種體液,以及組織樣品和排泄物。藥代動力學和其它生物分析的樣品基質均較復雜,干擾物多\\( 蛋白質、脂肪、激素、神經遞質和尿素等代謝物等\\) ,取樣量少,待測物濃度與內源性物質相比明顯偏低,因此要求生物分析方法的特異性強、靈敏度高、重現性好。藥代動力學研究和臨床藥物監測需要分析大量樣本,對分析的通量和方便簡便快速也有要求。目前,生物分析和藥代動力學研究首選色譜法,連接不同類型的檢測器\\( 紫外、熒光、電化學、質譜等\\) 的液相色譜可以適應不同類型化合物的檢測,應用最為廣泛。在過去的十多年中,隨著質譜接口技術的快速發展和分析靈敏度的提高,選擇性強、靈敏度高的液相色譜-質譜聯用技術\\( LC-MS\\) 已成為藥代動力學研究及其它藥物毒物生物分析的主導技術[2],其中,液相色譜的分離功能對于復雜基質或多組分樣品分析的靈敏度、重現性和準確性至關重要。二維液相色譜的出現,大大提高了分離效率,為這些樣品的分離測定提供了有力工具[3]。
血漿、尿、組織等生物樣品的成分復雜,在應用 LC-MS 及時進行定性與定量分析時,一般需要進行樣品的前處理,這是極為重要的環節,也常是最困難、最繁復的工作。前處理在復雜基質樣品分析中是最為耗時的部分,其結果將直接影響定性與定量分析結果的可靠性。有人認為,約 1/3 的分析誤差是由繁瑣的前處理步驟產生的[4],并占據了約 2/3 的工作量[5]?；诙S液相色譜的在線固相萃取技術,顯著簡化了樣品前處理工作,使得高通量的全自動樣品分析成為可能,在中藥有效成分分析、藥物質量分析、食品安全、環境科學等諸多領域得到廣泛應用[6~9]。近年來,這一技術在藥物代謝和生物分析中得以應用,并逐漸顯示優勢。
2 在線二維色譜原理、裝置及特點
二維液相色譜是將分離機理不同而又相互獨立的兩支色譜柱串聯起來構成的分離系統,通過柱切換技術完成樣品在二維色譜柱之間的流動。分析時,樣品經過第一維色譜柱的分離,進入切換閥的接口中,經捕集或切割后,被切換進入第二維色譜柱及檢測器。二維色譜按切割組分進入二維柱方式分為中心切割和全二維方式; 又可根據切割組分是否直接進入二維柱中,分為離線與在線兩種類型。目前用于分析的二維液相色譜大多應用在線方式,即一維洗脫產物全部或部分直接進入到二維色譜柱中進行分離分析。
在裝置方面,單泵系統與雙泵系統均能實現在線二維液相色譜分離[10]。雙泵系統可以采用臨時搭建的方式或者選用整合式色譜儀。圖 1A 所示的雙泵系統通常需要使用者額外添加一個泵、色譜柱和切換閥,以實現多條流路的切換。樣品首先通過一維泵將樣品裝載至一維色譜柱中進行洗脫分離,使用雙樣品環接口、停流模式或真空揮發的接口切換技術捕集洗脫產物,再用高濃度的二維泵流動相將保留在接口或一維柱上的分析物以正沖或者反沖模式從一維轉移到二維分析柱上繼續分離,由此能夠獲得更大的峰容量[11,12]。整合式色譜儀整合了二維色譜所需的雙泵、管路套裝與連接指導,例如 Ulti-Mate3000 型液相色譜儀,通過軟件操作和獨特的閥切換技術 \\( 圖 2\\) ,實現在線二維色譜的多種應用[13,14]。應用單泵系統,如圖 1B 所示,也可以實現二維色譜的操作[15,16],輸液泵將樣品裝載至 SPE 柱中,并將不保留物質沖洗至廢液中,之后關閉廢液位置,迫使梯度流動相經 SPE 柱流向分析柱。
與傳統的液相色譜和離線固相萃取色譜分析相比,在線二維色譜的優勢在于峰容量明顯提升、復雜樣品的基質效應和殘留現象顯著降低、以及自動化樣品前處理以提高分析的通量。在一維色譜模式下,如果峰數量超過了峰容量的 37%,色譜峰分辨率將明顯下降,而二維色譜的峰容量是一維與二維色譜分離峰容量的乘積[17~19],分離效率大大提高,因此可以用于多組分、復雜基質樣品的分離分析。將二維色譜的其中一維配置固相萃取柱,可以完成自動固相萃取、脫鹽和除蛋白、以及低濃度分析物的富集,復雜基質樣品可直接進樣,樣品的自動化前處理顯著改善了基質效應和殘留現象,提高分析的靈敏度和重現性,滿足大批量樣品的全自動和高通量分析要求。除此之外,由于整個分析過程在密閉系統中進行,可以減少樣品污染及可能發生的分析物降解[9,20,21]。
3 二維液相色譜在藥物代謝和體內分析中的應用
3.1 新藥發現和臨床前藥代動力學研究
新藥發現階段的代謝性質早期評價涉及大量化合物的快速篩查評價,體外評價實驗通常在 96 孔板上進行,分析方法的通量對于評價效率至關重要。Janiszewski 等[22]應用在線固相萃取-質譜技術建立了高通量的體外藥物代謝穩定性評價方法。他們用自己搭建的在線雙 SPE 柱固相萃取-液質系統,每個樣品分析時間 43 s,雙柱的交替樣品萃取可以實現每天 2000 個樣品的高通量評價。Luippold 等[23]采用相似的方法建立了超快速在線固相萃取進樣系統,分析速度進一步提高至每個樣品僅需 8 s,并將該方法用于 CaCo-2 細胞和 PAMPA 膜的新藥體外跨膜吸收性質評價,大大提高了分析速度和樣品通量?；谠诰€固相萃取-液質聯用技術的生物樣品自動化分析,以及雙柱,甚至多柱交替萃取方法,可顯著提高新藥設計和優化期大量化合物成藥性篩選評價的效率。
臨床前藥代動力學研究在實驗動物上評價藥物或候選藥物的吸收、分布、代謝和排泄性質,涉及的分析物類型多,不同分組和劑量產生大量的血漿、組織和排泄物樣品。在線固相萃取因其能提高樣品前處理的效率、降低生物樣品的干擾和基質效應、保證分析的靈敏度和重現性,已成為藥代動力學研究中高通量樣品分析最有潛力的技術之一[24],在血漿動力學[25~27]、組織分布濃度測定[28]、尿排泄[29]研究中得到廣泛應用。例如,為了滿足臨床前藥物開發高通量的要求,Ong 等[30]比較在線單柱和雙柱模式測定血漿中尼莫地平濃度,結果表明,單柱模式的分析時間為 4 min,而并聯雙富集柱的分析時間僅為2 min,分析速度提高了一倍。為此,他們采用如圖 3 所示的雙富集柱模式,提高分析速度,并進行了代謝穩定性、蛋白結合和 CaCo-2 單層細胞通透性等體外代謝性質的快速評價。生物樣品中藥物濃度通常較低,血漿藥代動力學研究一般要求方法的最低定量限在 μg/L 或更低的水平。當實驗室不具備液相色譜-質譜聯用儀時,通過優化前處理方法進行樣品清潔和待測物富集,可有效提高液相色譜檢測方法的靈敏度。Shang 等[31]采用在線 SPE-HPLC-DAD 法方法,同時測定自發高血壓大鼠血漿中尼群地平和氫氯噻嗪,在線固相萃取的血漿樣品,直接進樣量可提高至 100 μL,尼群地平和氫氯噻嗪的最低定量限\\( LLOQ\\) 分別降低至 0.5 和 0.6 μg/L,滿足了尼群地平和氫氯噻嗪的血漿藥代動力學研究要求。
3.2 藥物代謝產物和代謝酶研究
代謝產物的定性和定量分析是藥代動力學研究中具有挑戰性的工作。為了檢測到血、尿等雜基質中的微量未知代謝產物,有效去除內源性雜質,降低背景干擾就尤為重要。Mullett 等[32]采用雙 SPE 柱的串聯模式,研究了維拉帕米的代謝產物。他們先利用 RAM\\( Restricted access material\\) 柱清除樣品中蛋白質等大分子基質,再用 MIP\\( Molecularly imprinted polymer\\) 柱去除小分子雜質后,樣品進入分析柱中經 LC-MS 進行維拉帕米及其代謝產物分離鑒定。單 RAM 柱和 RAM-MIP 柱串聯的比較結果顯示,雙SPE 柱串聯洗脫模式能夠顯著降低背景雜質干擾,更有利于代謝產物的鑒定。
抗癌藥 5-氨基咪唑-4-氨甲酰\\( AICA\\) 核糖苷與其活性代謝產物 AICA 核糖酸的結構非常相似,差異僅在于前者是正離子化合物,而后者是陰離子化合物。由于它們的離子化效率偏低,LC-MS 方法不適用于二者的同時檢測。Cheng 等[33]建立了同時測定荷瘤裸鼠血漿中 AICA 核糖苷和 AICA 核糖酸濃度的二維 HPLC-DAD 方法,并成功用于荷瘤小鼠的藥代動力學研究。血漿樣品用三氯乙酸進行蛋白沉淀后,再經乙醚萃取以去除三氯乙酸,取水層 50 μL 進樣至在線 WAX-1 SPE 柱中,WAX-1 柱只保留陰離子化合物,因此 AICA 核糖苷被洗脫至二維柱\\( IonPac CG16 柱\\) 上進行色譜分離和 DAD 檢測,保留的AICA 核糖酸經閥切換后,洗脫至二維柱\\( HILIC-10 柱\\) 進行分離,由于經相對吸收光譜法評價峰純度后發現 AICA 核糖酸在 12.6 min 的出峰處仍存在雜質干擾,因此待 AICA 核糖酸從 HILIC-10 上被洗脫后,再串聯了一根 WAX-1 柱作為分析柱,對 AICA 核糖酸進行分離測定,雖然分析時間需要 40 min,但該方法不僅能夠同時檢測 AICA 核糖苷和 AICA 核糖酸,而且靈敏度更高,LLOQ 低至 100 μg/L\\( AICA 核糖苷\\) 和 30 μg/L\\( AICA 核糖酸\\) 。這個實例表明,在分離分析與內源干擾物性質相近的藥物及代謝產物時,二維或多維色譜技術是有效的解決方案,通過不同分離模式間的組合可有效解決復雜體系中的相似物質的分離。
藥物對代謝酶的抑制和誘導作用的評價,可以為藥物臨床合理應用提供信息或依據。Barrett 等[34]建立了在線固相萃取-LC-MS 方法定量分析人尿樣中氫皮質醇和 6β-羥基皮質醇濃度,以皮質醇和 6β-羥基皮質醇的濃度比值作為體內細胞色素 P4503A4 酶活性評價的指標。該方法快速靈敏,定量限為1 μg / L \\( 6β-羥基皮質醇\\) 和 0.2 μg / L\\( 皮質醇\\) 。Lim 等[35]利用在線固相萃取液質聯用技術,在 96 孔板上建立了高通量的細胞色素 P450 酶活性抑制評價方法。方法可平行評價 12 種化合物\\( 每種化合物8 個濃度\\) 對 6 個細胞色素 P450 酶亞型的抑制作用,每塊 96 孔板的分析時間僅為 14 min,比以往報道的需要 4 h 每板的 2-min LC-MS/MS,分析速度提高了 15 倍,實現了新藥候選物代謝酶抑制的快速評價。
3.3 人體血藥濃度監測
臨床藥物的血藥濃度監測是臨床合理用藥和個體化用藥的重要依據,對于那些有效濃度與中毒濃度相差較小,治療窗較窄的藥物,尤其重要。治療方案優化和血藥濃度監測需要有簡便、快速、重現性好的生物分析方法,無需繁復前處理的在線固相萃取技術得到了眾多應用[36~38]。紫衫萜、坦西莫斯及其活性產物西羅莫司是常用的廣譜抗腫瘤藥,它們治療窗窄、且由于受個體差異影響大其血藥濃度變幅較大,通常需要進行血藥濃度監測。Navarrte 等[39]采用自動在線固相萃取-液質聯用方法對人全血和血漿中的紫衫萜、坦西莫斯及其西羅莫司進行檢測,血漿樣品經過簡單蛋白沉淀后即直接進樣分析,整個過程僅用10 min,檢測靈敏度為 0.14~0.76 μg/L,適用于臨床化療時藥物劑量的調整以及聯合用藥時藥物相互作用的評價。茚達特羅是治療慢性阻塞性肺病的藥物,經特殊吸入裝置給藥,血漿中藥物含量較低。Emotte 等[40]利用在線固相萃取技術實現茚達特羅在 SPE 柱上濃縮富集,應用液質聯用儀分析檢測,靈敏度達到 10 ng/L,與離線 SPE 柱前處理的結果對比,二者之間的相關性良好,在線方法更快捷靈敏,可用于大批量臨床樣品的分析。因此,對于臨床用藥監測中的大量常規血樣或尿樣的定量分析,二維色譜技術有助于減少樣品前處理,提高分析的自動化程度,進而提高分析的準確性和重現性。
3.4 違禁藥物及毒物監測
對于體內濫用藥物和毒物中毒的分析監測,同樣要求能夠對樣品進行快速檢驗,其中快速靈敏的在線固相萃取技術已得到廣泛應用[21,41]。梁晨等[42]建立了在線的二維 LC-MS 方法,測定分析吸毒者尿樣中的嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因和乙?？纱?方法靈敏度高、又有效避免了單抗試劑盒可能出現的假陽性,可滿足實際案例快速檢驗的需要。Bouzas 等[43]比較了在線并聯 SPE-LC-MS 方法與傳統的離線 SPE-GC-MS 方法測定人血清中基本濫用藥物及其代謝產物濃度\\( 如嗎啡、可待因、苯丙胺等\\) 優劣性,在線 SPE-LC-MS 能夠高通量地滿足臨床和法醫血清樣品的常規分析要求。Guo 等[44]通過在線固相萃取技術測定人尿樣中 4 種促雄激素合成激素,該方法簡便、快捷、特異性好,且避免了使用 GC-MS 分析前不穩定的衍生化程序,同時可以 1 mL 尿樣直接進樣,使靈敏度比以往的方法提高了 10~100 倍\\( 0.01 μg/L\\) ,為促雄激素合成激素的臨床監測以及興奮劑檢查提供了一種實用的便捷手段。Mueller等[45]利用線固相萃取-LC-MSn和自建的質譜數據庫建立了能夠靈敏特異測定血漿、血清和尿樣中 453種化合物的快速毒物篩選系統,并成功應用于急癥和深切治療病患的血尿毒物分析,方法中 78%的化合物定量限低于臨床最低治療濃度,與大多數報道方法需要 1 mL 樣品量相比,該法需要樣品量更少\\( 100 μL\\) ,且 45 min 內即可獲得毒物分析報告,適用于大量樣品的篩查和常規分析。
3.5 內源性物質或生物標志物的檢測
生物標志物是一種能夠反映生理或病理或治療過程中的某種特征性的生化指標,對于健康狀況、疾病的快速診斷治療、早期藥物篩選具有重要意義,同樣地,高效靈敏的二維液相色譜在頭發、唾液和組織中內源性物質及生物標志物中也有較廣泛的應用[46~48]。8-羥基-2’-脫氧鳥苷\\( 8-OHdG\\) 是 DNA 氧化損傷的生物標志物,可以用以評價藥物毒物引起的 DNA 損傷毒性,經典的分析方法包括電化學檢測法和免疫檢測法。Wang 等[49]利用在線固相萃取-液質聯用技術測定人血漿中的 8-OHdG 含量,方法不僅省時省力,還可避免電化學檢測法中內源性物質的干擾和免疫檢測特異性低的問題,方法可用于評價疾病狀態以及人體接觸納米顆粒后的氧化應激狀態。
人體前列腺素 E2\\( PGE2\\) 由前列腺素 E2 合成酶-1 合成,在炎癥反應、疼痛、發燒和血管調節中發揮了重要作用。Fabian 等[50]通過測定 A549 微粒體孵育體系中前列腺素 E2含量,篩選微粒體前列腺素E2 合成酶-1\\( mPGES -1\\) 抑制劑。他們建立了在線固相萃取-HPLC-UV 方法,分別設計了單 SPE 柱和并聯 SPE 柱交替模式,并進行比較。結果證明,在線固相萃取法不需要任何前處理,靈敏度達到 57 μg/L;與單柱相比,并聯雙柱模式分析時間顯著縮短,為 mPGES -1 抑制劑的篩選提供了快速可靠的方法。同樣,Heinig 等建立在線萃取技術,以小鼠血漿、尿液和組織中糖皮質激素濃度水平作為生物標志物,進行11β-HSD1 抑制劑候選藥的藥效評價[51]。
內源性腦神經肽是重要的內源性調節劑,由于其含量較低和大腦組織基質的復雜性,使得定量測定很困難。一維液相色譜在測定腦神經肽時難以獲得足夠的分離度。Mihailova 等[52]建立了兩套在線二維液相色譜系統,即 HILIC-RP 和 SCX-RP 色譜系統,通過比較確定適用于缺氧應激條件下大腦神經肽含量測定方法。實驗結果顯示,HILIC-RP 系統可在一維柱分離后得到 19 個肽段,而傳統的 SCX-RP 系統的實際局限性僅得到 6 個,HILIC-RP 系統比 SCX-RP 系統獲得多于 3 倍的肽段信息,表明 HILIC-RP系統更適合腦神經肽的肽段組學比較研究。同時,為了防止 HILIC 和 RP 柱不兼容的問題,在兩柱間再加了一根 SPE 柱,使得流動相間的切換能夠平穩過渡。
3.6 手性化合物的分離和分析
在藥物研究中,常常需要對樣品中不同藥物或藥物手性異構體進行分離,二維液相色譜是手性化合物分離的有力工具之一。Mangani 等[20]建立了多柱在線切換-HPLC 技術對血清中常用的 6 種治療心血管疾病藥物進行分離測定,其中 β 受體阻斷劑吲哚洛爾是手性藥物。血清樣品先經過在線 SPE 進行純化,純化樣品洗脫進入RP-18 柱,用pH 2.5 的流動相洗脫,將吲哚洛爾與其它藥物完全分離,后者經 UV 檢測; 隨后通過中心切割,將吲哚洛爾引入手性 AGP 柱以 pH 7.0 的流動相進行二維手性分離分析。通過對流動相 pH 的調整,同一二維色譜法也可應用于其他藥物及其代謝產物的分離。Bester 等[53]則應用在線二維液相色譜法分離檢測生物樣品\\( 魚油、灰歐肝等\\) 中的六溴環十二烷\\( HBCD\\) 。市場上HBCD 是 3 種異構體 \\( α-HBCD,β-HBCD 和 γ-HBCD\\) 的混合物,且每種異構體還存在手性異構,盡管通過手性柱可以手性分離異構體,但 3 種異構體間的完全分離非常困難。Bester 等[53]的方法分別用Synergi polar plus 柱和 Nucleodex beta-PM 柱作為一維和二維柱,待測物先在一維柱上使異構體達到分離,再通過中心切割進入二維柱實現各手性異構體的分離。與以往的單柱或是串聯柱方法相比,該方法的分析物色譜峰不受其它異構體峰或雜質峰影響,有效峰容量提高了 2 倍,各異構體在二維色譜上達到更充分的分離。
4 展 望
經過十余年的快速發展,無論在儀器設備、技術上、還是在應用擴展方面,二維液相色譜均有顯著進步。在原有液相色譜的基礎上增加簡單配置,如添加一個泵和六通閥,實現在線二維液相色譜。色譜儀器廠家也已開發出了多種整合式的在線二維液相色譜系統,如 UltiMate 3000 型液相色譜儀、Rapid-FireTM SPE-MS 系統等。目前,二維液相色譜多采用在線模式與質譜相連,成功應用于各種復雜基質樣品中的小分子藥物和大分子蛋白等的分析。本文總結了近幾年在線二維液相色譜在藥物代謝領域,以及體內藥物、毒物和內源物生物分析方面的應用進展。大量應用實例展示了在線二維液相色譜在復雜生物樣品中藥物、毒物和內源物分析中的優勢,為生物分析中常見的基質干擾、前處理方法繁瑣、通量低、重現性和準確性較差等問題提供了有效的解決方案,近年來在藥代動力學研究及其它生物樣品的分析中得以廣泛應用。
但是,二維液相色譜的應用推廣還有一些問題需要進一步解決。例如,二維色譜柱系統選擇和方法建立,以及流動相的選擇和匹配相對復雜,需要繁瑣的軟件設置和支持,對專業知識和技能有一定的要求;因兼容性問題,進入二維柱的樣品常需要稀釋,導致方法靈敏度降低,影響生物樣品中痕量化合物的檢測;以及固相萃取柱和色譜柱的選擇性和可用性的限制等。隨著二維液相色譜的不斷發展完善,以及應用面的擴大和經驗的積累和總結,這一技術在體內藥物、毒物和內源性物質分析中將具有良好的應用前景。
