間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）由于來源廣泛，且具有自我增殖和多向分化潛能等特點，在再生醫學和組織工程方面具有廣闊的應用前景。 目前，關于MSC 成骨分化的研究很多， 但對 MSC 定向成骨分化的相關機制依舊不甚清楚，導致體內、外成骨效率仍然較低。 如何提高 MSC 的成骨性能已成為關注的熱點。 MSC 成骨性能受多種因素影響，炎癥是其中一個重要因素[1]. 巨噬細胞是炎癥免疫的關鍵調節者[2],其對 MSC 成骨分化的影響目前還存在較大爭議， 尤其是在巨噬細胞與 MSC 共培養條件下和巨噬細胞相關的單個炎癥因子刺激 MSC 的非共培養條件下。 筆者圍繞共培養和非共培養條件下巨噬細胞對間充質干細胞成骨分化的影響綜述如下。

1 MSC成骨分化

1976 年 Friedenstein 等[3]首次報道骨髓中存在可貼壁的、呈成纖維細胞狀的、可分化成骨的基質細胞。 1991 年Caplan[4]將這類細胞命名為 MSC.除了骨髓，MSC 還可來源于脂肪、肌肉、肝臟、外周血、胎盤、臍帶等多種組織[5~7].MSC 具有自我更新和多向分化潛能，在適宜的條件下能增殖并被誘導分化成骨、軟骨、脂肪、神經、心肌、肝臟等組織細胞[8、9]. 如何定向誘導 MSC 成骨分化是解決骨組織工程中種子細胞來源的前提。 MSC 成骨分化需經過細胞轉化、細胞增殖、細胞外基質合成及礦物質在細胞外基質中沉積四個階段[10]. Runt 相關轉錄因子 2（runt-related transcrip-tion factor 2,Runx2） 和 成 骨 特 異 性 轉 錄 因 子 Osterix（OSX）是 MSC 成骨分化的關鍵轉錄因子 , 可誘導下游成骨基因的表達，如：骨鈣素（osteocalcin,OCN）、骨橋蛋白（osteopontin,OPN）、 骨涎蛋白 （bone sialoprotein,BSP）、 Ⅰ型膠原蛋白（collagen Ⅰ，COLLa1）、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP） 等。 多條信號通路通過靶向 Runx2、Osterix 等調控 MSC 成骨分化過程， 主要信號通路包括轉化生長因子-β1（TGF-β1）、骨形態發生蛋白（bone morpho-genetic protein,BMP）、Wnt、Hedgehog （HH） 和 NELL -1 等信號通路[11~13]. MSC 成骨分化受多種因素的影響 ,包括細胞外微環境、細胞間的相互作用、物理因素、細胞結構差異等，其中細胞外微環境是最關鍵因素，尤其是炎癥微環境。

2 共培養條件下巨噬細胞對MSC成骨分化的影響

正常骨密度的維持是破骨細胞吸收與成骨細胞生成的動態平衡結果[14]. 破骨細胞和成骨細胞分別由巨噬細胞和 MSC 分化形成。 目前已有大量文獻證明共培養條件下巨噬細胞通過分泌不同介質， 如： 骨形態發生蛋白 2（BMP2）、 腫瘤壞死因子 α （tumour necrosis factor alpha,TNFα）、抑瘤素 M（oncostatin M,OSM）、外泌體等 ,參與調控 MSC 成骨分化。

2.1 BMP2、TNFα 介質

BMP2 是公認的誘導 MSC 成骨分化最重要的細胞外信號分子之一[15]. 早在 2002 年，Champagne 等[16]就發現小鼠巨噬細胞在生理狀態下能夠分泌 BMP2,其上清與人間充質干細胞（human mesenchymal stem cell,hMSC）共培養能夠促進 hMSC 成骨分化。 但是， 用脂多糖（lipopolysac-chariede,LPS）處理過的巨噬細胞分泌大量 TNFα，其上清抑制 hMSC 的成骨分化。 Pirraco 等[17]于 2011 年也發現利用 Transwell 培養板共培養巨噬細胞和 MSC, 在 Transwell上層板內種植人外周血來源的單核/巨噬細胞， 下層板內種植人骨髓來源間充質干細胞（human bone mesenchymalstem cell,hBMSC），發現人單核/巨噬細胞能夠促進 hBM-SC 增殖并誘導其成骨分化， 在培養基中加入 BMP2 抗體之后，MSC 成骨分化作用消失， 進一步證實共培養條件下單核/巨噬細胞通過分泌 BMP2 誘導 MSC 成骨分化。同時，Omar 等[18]指出，種植于不同材料（聚苯乙烯、金屬鈦）表面的經典性活化的單核細胞上清可提高 hMSC 內 BMP2 的表達而促進 hMSC 成骨分化。 另外，Chen 等[19]認為人巨噬細胞上清液可以抑制 BMP2 誘導人 MSC 成骨分化的過程，主要是由于上清液中含有大量的 TNF-α 和 IL-1β。Lee等[20]發現鈦顆?；罨男∈缶奘杉毎种菩∈笄俺晒羌毎晒欠只?， 主要是由于巨噬細胞分泌的 TNFα 抑制了Wnt 和 BMP2 信號通路。 可見，TNFα 是共培養體系中巨噬細胞抑制 MSC 成骨分化的主要介質之一。

2.2 OSM 介質

OSM 屬于白介素 6（IL-6）家族中的一類蛋白因子 ,因為其能抑制 A375 人黑色素瘤細胞的生長而被命名為OSM[21]. 近年來大量文獻證實共培養條件下單核/巨噬細胞可通過分泌 OSM 促進 MSC 的成骨分化。 Guihard 等[22]于2012 年發現，經典性活化（LPS 誘導）的 M1 型外周血來源的 CD14+和骨髓來源的 CD11b+的單核巨噬細胞可通過分泌 OSM 誘導人骨髓來源的 MSC 成骨分化，而抑制其成脂肪分化。同年，Nicolaidou 等[23]利用 Transwell 培養板進行共培養， 在上層板中種植人外周血來源的單核/巨噬細胞和hBMSC,在下層板中種植 hBMSC,發現只有在上層板中單核/巨噬細胞和 MSC 直接接觸的情況下才能誘導下層板中MSC 的成骨分化。 進一步的實驗發現，人單核細胞或巨噬細胞通過與骨髓來源的 MSC 直接接觸后分泌的細胞因子是 OSM,而不是 BMP2 或 TGF-β。 OSM 誘導 MSC 成骨分化的主要機制是：OSM 首先與細胞表面受體---糖蛋白130（gp130）/腫瘤抑制素 M 受體 （OSMR）、gp130/白血病抑制因子受體 （LIFR） 結合， 通過酪氨酸磷酸化途徑激活Janus kinase （JAK） 激酶家族信號轉導因子 , 活化的 JAK因子激活信號轉導和轉錄活化因子 3 （signal transductionand activator of transcription3,STAT3）[24], 活化的 STAT3上調下游的成骨相關基因 Runx2 和堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）， 下調抑制因子 （DKK1） 等成骨抑制基因，協同促進 MSC 向成骨細胞（OB）的過渡。 另外，MSC 細胞中 STAT3 活化之后，細胞表面受體 OSMR 和 LIFR 也表達上調，有利于 OSM 與 MSC 的結合，提高 MSC 的成骨效能。 2013 年，Fernandes 等[25]利用臍帶血來源的祖細胞，分別加巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）形成不成熟的增殖巨噬細胞和加巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）及 NF-kB配體的受體激活劑（RANKL）形成破骨細胞，收集該細胞的第 3 天上清液與 MSC 進行共培養， 發現巨噬細胞和破骨細胞的上清在有或無成骨誘導因子 （維生素 C、β 磷酸甘油鈉、地塞米松）的情況下，都能夠誘導人脂肪來源的MSC 成骨分化；通過在上清液中加入 gp-130 抗體或 OSM抗體后誘導 MSC 成骨分化作用消失， 證實共培養條件下巨噬細胞和破骨細胞是通過分泌 OSM 活化 MSC 表面受體 gp-130 而誘導 MSC 成骨分化；同時還發現，替代性活化巨噬細胞上清液也能夠誘導 MSCs 成骨分化，而經典性活化的巨噬細胞不能。 上述三人的結果不盡相同，主要原因是巨噬細胞的來源、 處理方法及共培養方法不同：Guihard 等強調的是巨噬細胞的表型， 只有外周血來源的CD14+和骨髓來源的 CD11b+巨噬細胞在經典性活化時才能分泌 OSM,從而促進 MSCs 成骨分化；Nicolaidou 等強調巨 噬 細 胞 只 有 與 MSCs 直 接 接 觸 后 才 能 分 泌 OSM;Fernandes 等是利用臍帶血來源的巨噬細胞。

2.3 外泌體介質

外泌體可穿梭于不同細胞的功能 RNA 和蛋白質內，是細胞間相互作用的強大介質[26、27]. 2013 年，Ekstrom 等[28]發現單核細胞與 MSC 共培養時可通過外泌體進行相互作用。 他們用 LPS 刺激人外周血來源的單核細胞，發現單核細 胞 分 泌 CD9+、CD63+、CD81+、 腫 瘤 特 異 性 糖 蛋 白（Tsg101）+和熱休克蛋白 （Hsp70）+的外泌體 ,同時檢測到外泌體內包含不同長度的 RNA. 該外泌體被人骨髓來源的 MSC 細胞吞 噬后 , 上調細胞 內 成 骨 關 鍵 轉 錄 因 子Runx2 和 BMP2 等，促進 MSC 成骨分化。

3 非共培養條件下巨噬細胞相關炎癥因子對MSC成骨分化的影響

巨噬細胞由外周血單核細胞分化而來， 在機體固有免疫和適應性免疫中發揮重要作用。 在不同的外部微環境下，巨噬細胞可表現出不同的功能和表型，M1、M2 是巨噬細胞的兩種主要極化類型。M1 又稱經典性活化，在體外可經干擾素（IFN）或 IFN+LPS 或 TNF 誘導形成，分泌多種促炎細胞因子，包括炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL -18）、 趨 化 因 子 （CCL15、CCL20、CXCL8 -11、CXCL13）、活性氧（ROS）和氮中間產物等，主要參與 Th1 型免疫應答，具有很強的殺傷抗原能力[29、30];M2 又稱替代性活化，主要由 IL-4 或 IL-4 和 IL-13 誘導激活， 又分為 M2a、M2b和 M2c,M2a 由 IL-4 或 IL-13 誘導形成，M2b 由免疫復合物聯合 LPS 或 IL-1β 誘導形成，M2c 由 IL-10、TGF-β、糖皮質激素誘導形成[31]. M2 型巨噬細胞抗原遞呈能力差，主要通過分泌細胞因子，如纖維連接蛋白、基質金屬蛋白酶（MMPS）、IL-1β、IL-6、IL-10 和轉化生長因子-β（TGF-β）等發揮抗炎及維持組織平衡功能[32、33]. 巨噬細胞通過 M1、M2 兩種極化表型分泌不同的炎癥細胞因子調控炎癥的發生、發展過程。

促進 MSC 成骨分化，提高 MSC 成骨性能是治療骨缺損的關鍵。 任何影響 MSC 成骨分化的因素都將影響骨的形成及骨組織的修復與再生。 不同極化狀態下巨噬細胞分泌的炎癥因子形成的炎癥微環境是影響 MSC 成骨分化的關鍵。 越來越多的證據表明非共培養條件下單個炎癥因子參與 MSC 成骨分化的調控。 Kong 等[34]認為 TNFα 可通過關鍵調控因子糖原合成激酶 3β（GSK3β）抑制 MSC 的成骨分化。 而 Hess 等[35]認為 TNFα 通過激活核轉錄因子 κb（NF-κb）促進 MSC 成骨分化。 Huang 等[36]也發現 TNFα 在低濃度時可促進 MSC 的成骨分化， 但是高濃度時卻抑制MSC 的成骨分化 . 同時， 也有文獻報道 IL-1β 可促進人MSC 成骨分化[37、38]. Huh 等[39]認為 IL-6 協同可溶性 IL-6受體通過活化 STAT3 促進脂肪來源間充質干細胞（ASCs）成骨分化。 OSM 屬于 IL-6 家族，其促進 MSC 成骨分化也是主要通過 STAT3 信號通路。 IL-10、IL-12、IL-18 等炎癥因子對 MSC 成骨分化的影響目前未見報道。

4 小結與展望

巨噬細胞是炎癥的關鍵調控者， 在骨的修復與再生過程中同樣發揮重要調節作用。 大量文獻已經證實巨噬細胞參與調控 MSC 成骨分化， 共培養體系中巨噬細胞通過分泌 BMP2、OSM、 外泌體等促進 MSC 成骨分化， 分泌TNFα 抑制 MSC 成骨分化。 非共培養條件下，巨噬細胞相關炎癥因子 TNFα、IL-6、IL-1β 及 OSM 等參與 MSC 成骨分化調控。IL-6、IL-1β 和 OSM 單獨刺激 MSC 時促進 MSC成骨分化， 而 TNFα 對 MSC 成骨分化的影響仍然存在爭議。 因此，可利用特定巨噬細胞及有利介質構建體外促進MSC 成骨分化的新模型 ,用于臨床大段骨缺損 、骨不愈合等的治療。 同時，應該進一步探索在體內骨折斷端及骨移植材料植入局部巨噬細胞對 MSC 成骨分化的作用及相關機制，為臨床骨缺損、骨不連、骨質疏松等疾病的治療和骨修復材料的設計與制備提供新的方法與策略。