內皮祖細胞（ endothelial progenitor cells,EPCs）是一群具有游走特性，能進一步增殖分化的幼稚內皮細胞； 缺乏成熟內皮細胞的特征性表型，是血管內皮細胞的前體細胞； 具有增殖、遷移、分化成內皮細胞和聚集形成新生血管的作用，主要參與出生后缺血組織的血管發生和血管損傷后的修復。Wnt3a 是wnt 家族的重要成員之一，其對細胞的增殖與分化等過程有重要的調控作用。本實驗以大鼠 wnt3a 基因為靶點，構建沉默型 pEGFP-shRNA-wnt3a 重組質粒載體，并用脂質體介導轉染大鼠骨髓源性 EPCs,觀察 wnt3a 蛋白表達水平的改變及對細胞增殖的影響，為進一步研究 wnt3a 及其下游靶基因調節 EPCs的功能研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 實驗動物 SD 大鼠 15 只，90 ~ 120 g,SPF級，雄性，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1. 1. 2 主要試劑 EGM-2 完全培養基購自瑞士Lonza 公司； 淋巴細胞分離液購自天津 TBD 公司； 大鼠纖維聯接蛋白（ rat fibronectin,FN） 購自瑞士 GeneOperation 公司； CD133 抗體購自美國 Biorbyt 公司；Dil 標記的乙酰低密度脂蛋白（ Dil-ac-LDL） 購自美國 Invitrogen 公司； 異硫氰酸熒光素荊豆凝集素-1（ FITC-UEA-1） 購自美國 Sigma 公司； 重組質粒（pEGFP-shRNA-wnt3a） 購自合肥昊翔生物科技有限公司； 脂質體 Lipofectamine 2000 購自美國 Invitrogen公司； wnt3a 一抗購自美國 Cell Signaling 公司； 二抗購于上海碧云天生物技術有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 EPCs 的采集、分離和培養 取 90 ~ 120 g大鼠頸椎脫臼法處死，無菌操作臺中取股骨及脛骨骨髓血，采用密度梯度離心法分離純化單核細胞； 用含 10%FBS 的 EGM-2 完全培養基，吹打分散細胞，計數細胞并以 1 ×107/ ml 的密度接種預包被 FN 的培養瓶； 置于 37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱中培養 4 d,棄去未貼壁細胞； 以后每隔 2 d 后換液 1次，每天觀察并記錄細胞生長形態變化。約 8 ~ 10d 后，細胞鋪滿瓶底即可傳代。

1. 2. 2 EPCs 的鑒定

1. 2. 2. 1 EPCs 免疫細胞化學 CD133 及 VEGFR-2雙抗體熒光檢測 取生長良好的原代 EPCs,用胰酶消化并接種于裝有蓋玻片的 24 孔培養板中，置于37 ℃ 、5% CO2的恒溫細胞培養箱中； 次日顯微鏡下可見 EPCs 生長良好，PBS 漂洗 3 遍，每遍 5 min; 加入 4%多聚甲醛固定 20 min,0. 3% Triton X-100 破膜 10 min,10% 山羊血清封閉 1 h,吸棄多余血清；滴加小鼠抗 CD133（ 1 ∶ 100） 及兔抗 KDR （ 1 ∶ 100）一抗，4 ℃ 過夜。次日 PBS 漂洗 3 遍，每遍 5 min.

加入二抗 （ 1 ∶ 500） ,37 ℃ 避光孵育 1 h; 加入終濃度為 10 μg/ml Hoechst33342 核染 5 min,吸棄多余染料，PBS 漂洗后加入抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡觀察結果。

1. 2. 2. 2 EPCs 的 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-1 熒光檢測 取生長良好的原代 EPCs,用胰酶消化并接種于裝有蓋玻片的 24 孔培養板中，置于 37 ℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中； 次日顯微鏡下可見 EPCs生長良好，PBS 漂洗 3 遍，每遍 5 min.每孔加入 10μg/ml 的 DiI-ac-LDL 500 μl,37 ℃ 避光孵育 4 h;PBS 漂洗后加入 4% 多聚甲醛于 4 ℃ 避光固定 10min,PBS 漂洗 3 遍，每遍 5 min.每孔加入 10 μg / ml的 FITC-UEA-1 500 μl,37 ℃ 避光孵育 1 h; 吸棄多余染料，PBS 漂洗后加入抗熒光淬滅液封閉，熒光顯微鏡觀察結果。