外排體\\(Exosome\\)是由多種細胞的胞內體衍生而來,通過出芽方式釋放到細胞外的一種脂質雙層膜性結構〔1〕,大小為40~100nm。由于其攜帶母細胞成分已逐漸被認為是細胞間進行信息交流,從而產生相互作用的新方式。樹突狀細胞\\(DC\\)作為一種體內分布廣泛、最強的抗原提呈細胞,在成熟的過程中可產生外排體\\(DCex\\)。DCex除表達一些 非特異性抗原外,還 表 達MHC-Ⅱ類 分 子、CD83、CD86、CD80等免疫抗原,許多研究證實其具有激活免疫反應、抗腫瘤的作用〔2〕。近年來,越來越多的研究表明DCex也具有誘導免疫耐受的功能〔3〕。因此,由于DCex的免疫調節功能和其本身的穩定性、易獲得性,已在腫瘤治療、誘導移植耐受和治療自身免疫性疾病中引起廣泛關注。間充質干細胞\\(mesenchymal stem cells,MSC\\)是一種來源于中胚層、成纖維樣貼壁生長的細胞,因其具有多向分化潛能、免疫調節和分泌細胞因子的能力,已成為研究治療免疫疾病和組織修復等的重要手段。

MSC可調節多種免疫細胞的功能,其中DC是MSC免疫調節作用中重要的效應細胞,其重要性已經在MSC應用于造血干細胞移植的臨床試驗中得到證實。然而,細胞間的調節可能是雙向的,在MSC影響DC成熟及發育的同時,DC是否也對MSC能產生作用,目前尚未見到相關報道。本文將主要在體外進行探 討DC是 否 可 以 通 過 釋 放DCex的方式對MSC增殖產生影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑
人骨髓標本來自于空軍總醫院血液科健康供者,標本采集經醫院倫理委員會要求執行;人淋巴細胞分離液Ficoll\\(1.077g/ml\\)購于天津灝洋生物制品科技有限公司;α-MEM、RPMI-1640基礎培養基購自美國Gibco公司;胎牛血清\\(FBS\\)購自Hy-clone公司;重組人粒細胞-巨噬細胞刺激因子\\(GM-CSF\\)、重組人白細胞介素-4\\(IL-4\\)、腫瘤壞死因子α\\(TNF-α\\)均購于北京新明力泰生物科技有限公司;脂多糖\\(LPS\\)、MTT購于美國Sigma公司;CFSE染料購于北京碧云天生物科技有限公司;PE或FITC標記的鼠抗人CD83、CD86、CD80單抗、Per-cp標記的HLA-DR單抗購自于美國BD公司。

1.2 方法
1.2.1 人骨髓MSC的分離、培養及鑒定實驗室骨髓標本取自骨髓移植健康供者,經知情同意以及醫院倫理委員會批準后采集。細胞分離、培養及鑒定按本 實 驗 室 常 規 方 法 進 行〔4-6〕。將 骨 髓 液 用PBS以1︰1的比例稀釋后沿離心管壁緩慢加到淋巴細胞分離液\\(Ficoll液\\)上,以2 000r/min離心30min,吸出白膜層細胞,即為單個核細胞。

PBS洗滌2次后接種于含10%FBS的α-MEM培養液中,經72h后去除非貼壁細胞,更換新培養液。以后每3天更換新鮮培養液。當細胞80%~90%融合時,胰蛋白酶消化傳代。取P3代細胞進行流式鑒定和誘導分化功能鑒定,細胞高表達CD44和CD73,不表達CD31和CD45。此外,細胞具有體外成脂和成骨分化能力。取第3~5代細胞用于實驗。

1.2.2 人骨髓來源DC的培養及鑒定同上分離得到單個核細胞,按2×106/ml細胞密度接種于含10%FBS的RPMI-1640培養液中,靜置于37℃、5%CO2孵箱。2h后去除非貼壁細胞,更換為含GM-CSF 1 000 U/ml、IL-4 500 U/ml的培養液。隔天半量換液。第5天加TNF-α1 000U/ml促進DC成熟。48h后收集細胞進行流式鑒定。

1.2.3 DCex的制備按Théry等〔7〕方法,DC經LPS\\(10ng/ml\\)刺激24h后收集培養上清,3 500r/min離心10min去除細胞大碎片,繼續過0.22μm濾膜以去除更小碎片,將上清液加入超離管中,在4℃、絕對平衡的條件下超速離心\\(100 000r/min,1h\\)后倒掉上清液,PBS重懸后再次超速離心,收集DCex。將DCex分裝后-80℃保存待用。

1.2.4 DCex電鏡觀察及表面分子檢測吸取15μl上述步驟中提取的DCex懸液,滴于銅網上,靜置2min后用濾紙慢慢吸干,加20μl磷鎢酸于銅網上負染2min后濾紙吸干,PBS洗滌1次,白熾燈下烤20min后放于電鏡下觀察。應用乳膠珠子\\(Beads\\)結合法檢測DCex攜帶抗原。將0.1μgBeads\\(105個左右\\)加入1.5 ml離心管中,MESbuffer離心洗滌2次,重懸于MES buffer中,加入5μg DCex,室溫孵育1h,4℃條件下輕晃孵育過夜。加入甘氨酸封閉液30min后用3%FBS離心洗滌3次,加入單克隆抗體避光反應40min,3%FBS洗滌2次。應用細胞流式儀進行檢測。

1.2.5 MTT法檢測MSC增殖將MSC重懸于無血清α-MEM培養基中,按照5×104/ml細胞數接種于96孔板,每孔總體積為100μl,分別加入為不同濃度的DCex\\(0、1、2、5、10、15μg/ml\\),置于37℃、5%CO2孵箱分別培養24、48、72h后加入MTT 10μl,37℃孵育4h后棄去液體,加入二甲基亞砜100μl,在490nm波長下測定吸光度值,分析細胞增殖情況。用不同來源的MSC重復實驗3次。

1.2.6 CFSE標記及流式細胞術驗證MSC增殖取第3代MSC,PBS離心洗滌2次,加入CFSE染料\\(1μl/ml\\),37℃、5%CO2孵箱中反應15min,間斷搖晃混勻。

PBS離心洗滌2次后重懸于無血清的α-MEM培養基中,按照5×104/孔接種于6孔板中,不同濃度的DCex\\(0、5、10、15μg/ml\\),在37℃、5%CO2孵箱中分別培養72h后收集細胞進行流式熒光檢測。利用ModFit軟件分析數據,以獲取各組增殖指數\\(PI\\)進行比較。用不同來源的MSC重復實驗3次。

1.3 統計學處理
采用SPSS17.0軟件進行分析。實驗數據以珚x±s表示,組間比較采用one-way ANOVA和t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DC的形態及表型特征倒置顯微鏡下觀察培養第4天可見聚集成團的細胞,邊緣呈毛刺狀\\(圖1a\\),培養第7天可見細胞散在貼壁生長,胞體較大,可見明顯樹突狀突起,具有DC的特殊形態\\(圖1b\\),流式檢測部分DC表達CD86、CD83、CD80、HLA-DR\\(圖2\\)?！緢D1-2.略】

2.2 DCex的形態及流式鑒定電子顯微鏡觀察到本實驗所收獲DCex為圓形或橢圓形的囊性結構,直徑為40~100nm,符合外排體形態特征\\(圖3\\)。進一步表面抗原分析發現,與來源DC相似,DCex也表達HLA-DR、CD86和CD83,部分表達CD80\\(圖4\\)。證明所獲DCex來源于DC?！緢D3-4.略】

2.3 DCex促進MSC增殖MTT實驗結果顯示,培養72h后不同濃度DCex促 進MSC增 殖 作 用 見 表1。與0μg/mlDCex組比較,5、10、15μg/ml DCex組細胞均在48h出現促增殖作用\\(P<0.01\\)。CFSE標記及流式檢測也證實DCex濃度為5、10、15μg/ml組與0μg/ml DCex組比較,PI逐漸增高,見圖5?！緢D5.略.表1】

3 討論

DC是功能最強大的特異性抗原遞呈細胞,在誘導T細胞活化、抗腫瘤及免疫耐受中起重要作用,成熟的DC特異性表達MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子、CD80、CD83、CD86等共刺激分子是其免疫作用的 分 子 基 礎 。

DCex是DC成 熟 過 程 中 分 泌 的 一種攜帶有MHCⅡ類分子、CD80、CD86等特異性抗原肽的脂質雙層膜性囊泡,近年來越來越多的研究發現DCex具有抗腫瘤、誘導免疫耐受的作用,同時,由于其非細胞性、穩定性高、儲藏時間長等優點而引起極大關注。

MSC是一類廣泛分布于各種不同的組織如骨髓、外周血、臍血、脂肪、胎盤、骨實質等中的具有多分化及自我更新能力的干細胞。

Li等〔8〕研究發現MSC能有力地促進DC增殖且明顯地下調其表面MHC、CD80、CD86及CD40的表達,并且提出細胞與細胞間的直接接觸是可能的機制之一。表明MSC能抑制DC抗原呈遞能力,從而調節DC的分化、成熟。細胞間的作用是相互的,通過本實驗發現,DCex可促進MSC的增殖,提示DCex可能是DC與MSC相互作用的一種新介質。

研究表明,DCex具有免疫抑制和免疫增強的雙重作用〔9〕,不但可以誘導免疫耐受,也可刺激特異性細胞毒T淋巴反應。因此,研究者推測DCex可能作為腫瘤免疫和自身免疫性疾病治療的新工具〔10-11〕。MSC具有很強的免疫調節作用。本實驗證實DCex可促進MSC增殖,提示在MSC存在的條件下,DC可通過釋放DCex,間接增強MSC的免疫調節功能。利用DCex治療類風濕性關節炎等疾病時,可能促進骨組織中富含的MSC的增殖〔12-13〕,從而加速骨損傷修復,并可能增強DCex的療效。這種推測值得進一步研究探索。

DCex含有與其功能關系密切的特殊蛋白質,包括CD55、CD59\\(避免DCex受到補體系統的攻擊\\);MFG-E8、Mac-1α/β\\(細胞靶向作用\\);hsc73和hsp84\\(抗原肽結合作用\\);annexins\\(Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ\\)、rabGD1、rap1B和rab7\\(膜融合作用\\);ICAM-1/CD54、CD11b、CD11c和CD58\\(粘 附 作 用 \\);Alix、TPx、14-3-3和galectin-3\\(凋亡作用\\)〔14〕。在這些蛋白中,與靶向作用相關的蛋白如MFG-E8,與粘附作用相關的蛋白如ICAM-1,與膜融合作用相關的蛋白如annexins\\(Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ\\),都被看作是DCex與細胞的相互作用是起作用的,因此DCex促進MSC增殖的機制是否與DCex的成分相關,需進一步驗證。

DCex作為一種新型疫苗在抗腫瘤免疫和誘導移植耐受中顯示出了巨大的應用前景,同時MSC的造血支持與免疫抑制作用被臨床應用于治療自身免疫性疾病及血液系統疾病,然而MSC植入體內的效率及安全性也給人類帶來了挑戰。人體的免疫系統是一個整體,各種免疫細胞是相互聯系、相互作用的,在細胞及免疫治療的過程中,二者在復雜的體內環境中產生哪些變化,是如何相互作用和相互調節的,值得進一步探討。