腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化及較強增殖能力的少量干細胞樣癌細胞亞群，是腫瘤起源、生長、轉移與復發的根源所在。近年來，尋找靶向殺死腫瘤干細胞的抗癌策略已成為研究的熱點。其中，選擇何種細胞表面標志物來證實舌癌中腫瘤干細胞的存在并完成對腫瘤干細胞的提取和鑒別是首要亟待解決的問題。研究發現p75神經營養蛋白受體（p75 neu-rotrophin receptor，p75NTR）的表達與多種腫瘤的發生和發展相關，并已證實其在全身多種腫瘤中可以作為一種腫瘤干細胞的表面標志物。本實驗采用p75NTR對舌鱗狀細胞癌細胞系Tca-8113及Cal-27進行標記、檢測、分選，并對分選后的p75NTR陽性細胞進行生物學特性研究，探討p75NTR作為腫瘤干細胞標志物和預測口腔鱗狀細胞癌愈后指標的可能性，為深入研究舌鱗狀細胞癌的發病機理和尋找新的治療靶點提供線索。
1、 材料和方法
1.1 材料
Tca-8113、Cal-27細胞株來源于口腔舌鱗狀細胞癌，由上海交通大學附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室惠贈。Tca-8113細胞株用含10%FBS（杭州四季青生物工程材料研究所）的RPMI1640培養液培養。Cal-27細胞株用含10%FBS（GIBCO公司，美國）的高糖DMEM培養液培養。
PE標記的鼠抗人p75NTR抗體及PE標記的小鼠骨髓瘤蛋白IgG1,κ抗體均購自美國BD公司。
1.2 流式細胞儀檢測p75NTR陽性細胞的表達。將生長狀況良好并處于對數生長期的Tca-8113細胞制備成單細胞懸液，并且調整細胞密度為1.0×106個·mL-1。實驗分為2組，實驗組加入100 μL PE標記小鼠抗人p75NTR抗體，對照組加入等量的PE標記小鼠骨髓瘤蛋白IgG1,κ。放入冰里置于震蕩箱中蔽光孵育半小時，1 000 r·min-1離心5 min，吸棄上清后Buffer I l mL沖洗吹打（反復沖洗、離心2次），重懸于400 μL PBS中。將加入等量PE標記小鼠骨髓瘤蛋白IgG1,κ的對照組先上機調節機器參數，然后取實驗組上機檢測細胞熒光值，分析p75NTR陽性細胞的百分含量，重復3次取平均值。同法處理Cal-27細胞。
1.3 p75NTR陽性細胞生物學特性檢測1.3.1 以p75NTR為標記分選陽性細胞作為實驗組 將生長狀況良好并處于對數生長期的較大數量的2種舌鱗狀細胞癌細胞（約1.0×108個·mL-1）如上法處理后上機進行高速分選，獲得p75NTR陽性細胞，作為實驗組。為了保證分選后富集的p75NTR陽性細胞的純度，分選時選取強陽性區域。重復上機一次，以避免標記物丟失造成的陽性率偏低。并取適量分選后的細胞上機檢測p75NTR陽性細胞的純度。
1.3.2 對照組處理 將同等條件培養的2種舌鱗狀細胞癌細胞系細胞制備成單細胞懸液，加入PE標記小鼠抗人p75NTR抗體，放入冰里置于震蕩箱中蔽光孵育半小時，再放入離心機離心5 min（1 000 r·min-1），棄上清后Buffer I l mL沖洗吹打（反復沖洗、離心2次），作為對照組備用。
1.3.3 單克隆培養 取對數生長期的2組細胞于超凈臺中常規消化制成單細胞懸液后，用有限稀釋法接種于96孔板中。5%CO2、37 ℃飽和溫度環境培養觀察細胞貼壁情況，記錄僅有一個細胞的孔，并做標記。2周后統計單克隆形成率。收集p75NTR陽性細胞形成的單克隆細胞，培養于培養瓶中，再培養2周后進行p75NTR的流式細胞檢測。
1.3.4 四甲基偶氮唑鹽比色法[\\(3-\\(4,5\\)-demethylthiazo\\(z-y1\\)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT]實驗 收集2組細胞，分別接種于96孔細胞培養板中（每孔約4×103個細胞）（周邊空不加），再各加入200 μL培養液（周邊空不加，B3孔只加入PBS作為對照）。
培養24 h后，換液，B3孔換200 μL PBS。每孔加入20 μL MTT溶液，培養4 h后吸出上清液，加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于搖床上低速震蕩10 min。以B3孔為調零孔，上酶聯免疫檢測儀，以490 nm吸光度值量化活細胞數，每次檢測一豎列的6個平行孔，每組所得數據取平均值，連續檢測7 d。以生長時間為橫坐標，以光密度（op-tical density，OD）值為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。
1.3.5 劃痕實驗 將2組細胞以每孔1×105個的密度接種于六孔板中，待細胞生長到80%~90%時，無菌條件下更換為無血清的培養基，繼續培養12 h后，于超凈臺中用200 μL槍頭在每個孔的中間劃一條豎直的線，PBS沖洗3遍。每孔加入2 mL完全培養液，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。之后每天換液，拍照，連續8 d。
1.4 統計學分析
采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。各組間的比較采用χ2檢驗進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。
2、 結果
2.1 流式細胞儀檢測p75NTR
陽性細胞的表達舌鱗狀細胞癌細胞株Tca-8113、Cal-27細胞中，p75NTR陽性細胞的比例分別為3.1%和1.9%。
2.2 流式細胞分選及純度檢測
分選后p75NTR陽性細胞的比例分別為98.1%（Tca-8113）和97.4%（Cal-27）。這表明目的細胞陽性率比較高。
2.3 單克隆培養
2組單克隆形成能力的比較見表1。從表1可見，只有小部分細胞能持續分裂增殖。實驗組的單克隆形成能力高于對照組（Tca-8113細胞，P=0.024；Cal-27細胞，P=0.009）。這表明p75NTR陽性細胞具有自我更新和分化能力。單克隆細胞再培養2周后，Tca-8113的p75NTR陽性細胞率降為14.5%，Cal-27的p75NTR陽性細胞率降為5.8%。
2.4 MTT實驗
細胞生長曲線（圖12）表明：2組細胞第1天生長情況無明顯差異，從第3天之后實驗組細胞較之對照組細胞體外增殖能力明顯增強，第5天及第7天時更加顯著（P<0.05）。
2.5 劃痕實驗
劃痕后7 d，實驗組較對照組具有明顯的愈合能力（圖34）。Tca-8113實驗組到第8天已經基本被細胞長滿，而對照組卻仍有空白區域（圖5），Cal-27實驗組到第5天已經基本長滿劃痕區域，完全長滿需要7 d（圖6）。這說明實驗組具有明顯的侵襲遷移能力。
3、 討論
腫瘤干細胞是腫瘤起源、生長、轉移與復發的根源所在。近年來，通過對其生物學特性的研究，尋找靶向殺死腫瘤干細胞的抗癌策略成為研究的熱點。p75NTR是一種神經營養因子的低親和力受體，可通過不同的信號傳導通路誘導細胞發生增殖、分化、遷移、凋亡等生物學行為。近年來，研究發現p75NTR的表達與胃癌、視網膜成神經細胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤的發生和發展相關，并已證實其在全身多種腫瘤中可作為一種腫瘤干細胞的表面標志物。本實驗檢測發現p75NTR在舌鱗狀細胞癌細胞系Tca-8113及Cal-27中都有陽性表達，且其陽性率分別為3.1％和1.9％。這與以往報道中腫瘤干細胞數量相當。
腫瘤細胞的克隆形成能力與其致瘤能力呈正相關，并且只有腫瘤干細胞具有單克隆形成能力和強致瘤性。本研究單克隆培養實驗發現兩個細胞株的p75NTR陽性細胞的體外單克隆形成能力相對于未分選的細胞均顯著增強，符合其是具有自我更新能力的腫瘤干細胞的理論。同時，本實驗利用流式細胞儀檢測發現單克隆4周后的p75NTR陽性細胞的p75NTR陽性率明顯下降，其分化產生了大量p75NTR陰性細胞，該結果說明p75NTR陽性細胞具有較強的克隆形成能力并具有一定的分化潛能。
本研究用MTT法對舌鱗狀細胞癌細胞株Tca-8113和Cal-27中的p75NTR陽性細胞及未分選細胞的體外增殖能力進行測定，發現p75NTR陽性細胞的生長速度明顯快于未分選的細胞，這也表明p75NTR陽性細胞具有較強的增殖能力，符合其作為腫瘤干細胞的特性。侵襲轉移是惡性腫瘤最重要的生物學行為，是導致手術、放療、化療失敗和患者死亡的主要原因。劃痕實驗證明p75NTR陽性細胞具有更強的遷移能力。
由于2種細胞的生長速度差別較大，所以在劃痕實驗中沒有做同期的橫向比較。
綜上，筆者認為p75NTR可作為舌鱗狀細胞癌干細胞的一種表面標志物。由于本課題組前期實驗發現p75NTR在正常舌組織中是陰性表達的，那么針對p75NTR這個新的靶點對腫瘤進行的治療就不會對正常舌干細胞構成傷害。當然，針對臨床應用還需要更深入的研究，但是相信隨著研究的不斷進展，其將有望為舌癌的臨床預防和診治開辟新的思路和策略。
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