間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有高度增殖和多譜系分化能力，與各種組織的功能維持與修復再生有著密切的聯系。但 MSC可在體內外環境的影響下，出現增殖能力下降，甚至發生凋亡等現象。在這些影響因素中，活性羰基類物質（reactive carbonyl species，RCS）對 MSCs的生物學行為的影響尚未報道。RCS 主要由多不飽和脂肪酸過氧化，在氧化應激條件下，其生成量顯著增加.對組織功能和正常更新產生嚴重影響。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是一種代表性的RCS。本工作進行以小鼠骨髓 MSCs 的體外培養，研究 MDA 對這種干細胞凋亡的影響，為全面認識 RCS 的病理生理作用提供實驗證據。

1、 材料與方法

1.1 材料

雌、雄性 Balb/c 小鼠各半，6~8 周齡，體重20±1.5 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，1，1，3，3-四甲氧基丙烷（美國 Fluka 公司）；低糖 DMEM 培養基（美國 Gbico 公司）；胎牛血清（美國 Hyclone 公司）；熒光定量 PCR 儀（7500 fastrealtime system, 美國 ABI 公司）；TRIzol 試劑（美國 Inritrogen 公司）；Taq man 逆轉錄酶試劑盒和SYBR Green MasterMix \\(美國 Applied Biosystems公司；Anti-Bcl-2；Anti-Bax；Anti-Caspase-3（美國 Santa Cruz 生物公司）；Anti-actin（美國 Sigma公司）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（美國 Roche公司）。

1.2 MDA 的配制

將 0.423 mL（2.5 mmol/L）的 TMP 與 1.0 mol/L的 HCl 2.0 mL 混合后，在 40 ℃的水浴中振蕩水解 2.5 min，TMP 完全水解后用 6.0 mol/L 的 NaOH調節 pH 值至 7.2，最后用 PBS 定溶到 50 mL，并測定儲備液在 267 nm（ε=31 500）的紫外吸收值來確定是否符合要求濃度。利用酸水解 1，1，3，3-四甲氧基丙烷（TMP）法配置 50 mol/L 的 MDA 儲備液。

1.3 MSC 的體外培養

無菌條件下取小鼠雙側股骨脛骨，以 DMEM培養液沖洗髓腔，獲得骨髓細胞，制備骨髓單細胞懸液。將骨髓有核細胞種于培養瓶中，接種密度為每 mm2培養瓶底 5×106個，培養體系為含 10%胎牛血清的 DMEM，于 37 ℃、10% CO2、飽和濕度下培養。每 3 d 更換培養液，繼續培養, 細胞至鋪滿瓶底時，用胰蛋白酶消化法收集貼壁細胞,于同樣培養體系和條件下傳代培養, 以擴增和純化骨髓MSCs. 取傳代培養 P3 代的 MSCs，實驗組另加MDA（終濃度為 0、0.01、0.1、1.0 mmol/L），培養 24 h后，所有組更換培養基，繼續培養 9 d。

1.4 流式細胞技術

細胞以 2×l03/cm2細胞密度接種于細胞培養瓶中，每瓶 8 mL，培養至 7 d，用胰蛋白酶將細胞消化，取單細胞懸液 2×106個細胞于 PBS（pH=7.2）緩沖液中，500 g 離心 5 min，棄上清，反復兩次，將單細胞懸液放置于 2～3 mL 冷 70%乙醇中，混勻，保存于 4 ℃，至少 30 min，離心洗滌兩次，加入PI，上機檢測。

1.5 TUNEL 法

實驗具體步驟參照 Roche 公司細胞凋亡試劑盒說明書, 結果分別用熒光顯微鏡觀察。凋亡細胞即 TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end label－ing）陽性細胞，在熒光顯微鏡下呈黃綠色熒光，非凋亡細胞無熒光顯示。油鏡下，每一組隨機觀察500 個細胞，分別計數視野內 TUNEL 陽性細胞和TUNEL 陰性細胞。 以凋亡細胞數與細胞總數的比率作為該標本的凋亡指數 （Apoptosis index，AI），計算 4 組凋亡指數。

1.6 熒光定量 PCR

各組細胞經 7 d 誘導培養后，RNA 的分離提取，按 Trizol 試劑說明書進行。按 Taq Man 試劑盒要求，2 μg RNA 被逆轉錄成 cDNA。用 SYBRGreen MaterMix 試劑檢測待測的基因的 mRNA 水平，共重復檢測 3 次。PCR 反應條件：95 ℃ 45 s,94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s, 72 ℃ 90 s, 35 個循環, 72 ℃延伸 10 min。mRNA 水平用 β-Actin 作內對照標化，基因的表達用△△Ct 法定量分析。PCR 引物序列見表 1。

1.7 Western 印跡分析

用冰冷的 PBS 洗滌細胞 3 次，加細胞裂解液，在冰上將細胞迅速刮下，冰浴條件下超聲破碎細胞，離心后吸出上清液體，用 Bradford 方法進行蛋白質濃度測定，取提取的蛋白質樣品（25 μg）加入等體積上樣緩沖液，100 ℃煮 5 min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉移至 PVDF 膜上，封閉液室溫封閉 1 h，1∶1 000 一抗 4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌 3 次，1∶2 000 二抗室溫孵育 1 h，TBST洗滌 3 次，ECL 發光顯影。條帶進行圖像分析，測定灰度值，用 β-Actin 作內對照標化來表示各組MSC 的 Bcl-2、Bax、Caspase-3 相對表達量。

1.8 統計學處理

所有數據用平均值±標準差（x±s）表示。多組間比較，采用方差分析；顯著性水平為 P<0.05。Sigma Plot 計算機軟件作圖。

2、 結果

2.1 MDA 增加 TUNEL 陽性細胞百分率如圖 1 所示，與對照組相比，0.1、1.0 mmol/LMDA 處理組 TUNEL 陽性細胞百分率明顯增加。0.01 mmol/L 組 TUNEL 陽性細胞百分率，與對照組差異無顯著性。

2.2 MDA 增加 MSC 亞 G1 峰凋亡細胞百分比流式細胞術結果顯示，與對照組相比，MDA處理使得 MSC 亞 G1 峰凋亡細胞百分比增加。0.01、1.0 mmol/L MDA 處理作用更明顯，呈一定的劑量相關性（見圖 2）。

2.3 MDA 降低 Bcl-2 mRNA 及蛋白的表達與對照組相比，MDA 處理組的 Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平隨著濃度增加，明顯降低，呈濃度依賴性，這表明 MDA 能降低 Bcl-2 mRNA 及蛋白的表達，結果見圖 3。

2.4 MDA 增加 Bax mRNA 及蛋白的表達與對照組相比，MDA 處理組的 Bax mRNA及蛋白表達水平隨著濃度增加明顯增加，呈濃度依賴性，這表明 MDA 能增加 Bax mRNA 及蛋白的表達，結果見圖 4。

2.5 MDA 對 Bax/Bcl-2 比值的影響如圖 5 所示，與對照組相比，MDA 處理能夠增加 Bax/Bcl-2 mRNA 表達水平比值；中高濃度1.0、0.1 mmol/L MDA 增加 Bax/Bcl-2 比值的作用更加明顯，呈濃度依賴性。

2.6 MDA 對 Caspase-3 mRNA 及 蛋白相對表達水平的影響。

如圖 6 所示，與對照組相比，MDA 處理組的Caspase-3 mRNA 及蛋白表達水平隨著濃度增加明顯增加，呈濃度依賴性，這表明 MDA 能增加Caspase-3 mRNA 及蛋白的表達。

3、討論

本實驗的結果表明，MDA 能夠誘導小鼠骨髓MSC 細胞凋亡。Rittie研究發現，丙二醛結合蛋白的影響成纖維細胞的功能。 Long 報道MDA 抑制離體大鼠肝線粒體呼吸功能以及酶的活性，線粒體功能障礙與多種老年性退行性疾病密切相關。用 MDA 處理大鼠海馬 CA1 區神經元后，細胞內線粒體發生變形、嵴消失，從而導致空間學習、記憶能力降低。MDA 與多種老年性退行性疾病密切相關?；钚贼驶愇镔|丙酮醛（methylglyoxal，MGO）損傷海馬神經元細胞導致其認知功能的降低。凋亡調控細胞增殖與更新間的平衡，這種平衡對維持生物體的發育及正常功能結構起著十分重要的作用。因此，MSC 的凋亡與多種器官組織退行性改變密切相關。

凋亡的亞細胞和分子方面的調控已被廣泛研究，凋亡級聯反應的主要調節因子是 Bcl-2 家族成員，包括促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白。脂質過氧化產物 4-羥基壬烯醛（4- hydroxy-nonenal，4-HNE）通過降低 Bcl-2 的表達，增加 Bax 的表達從而誘導 PC12 細胞的凋亡。我們首次報道 MDA 誘導的 MSC 細胞凋亡機制中涉及 Bcl-2 家族成員，Bcl-2 及 Bax 的調節。

天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶（Caspases）家族的激活在哺乳動物細胞凋亡過程中起關鍵作用，是凋亡的執行者。 Kutuk 等報道：4-HNE通過線粒體釋放細胞色素 C，激活 Caspase-3 誘導 3T3 成纖維細胞的凋亡，與多種老年性退行性疾病密切相關。Almeida 等報道 4-HNE 誘導小鼠成骨細胞的凋亡，是老年性骨質疏松癥的機制中重要環節。MDA 是否可以直接激活 MSC 細胞Caspases 家族尚未見報道。我們的研究發現，MSC經 MDA 處理后，Caspase-3 表達增強，這一現象提示 Caspase-3 的激活在 MDA 誘導的 MSC 細胞凋亡過程中的起到重要作用。

綜上所述, 我們的研究首次發現，丙二醛可誘導小鼠骨髓間充質干細胞的凋亡，其作用機制涉及 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 基因表達水平的變化，這為全面了解 RCS 提供了相關的實驗數據。