血管平滑肌細胞（vascularsmoothmusclecells，VSMC）對維持動脈壁結構和功能的完整性起到了重要作用。OPG作為腫瘤壞死因子受體超家族成員及細胞核因子-κB受體活化因子配體的誘導受體，不僅參與了骨的代謝過程，也參與了血管壁的鈣化。目前已經有大量研究證實OPG與人類心血管疾病之間存在一定的關系。盡管OPG在骨代謝過程中的作用已經逐步被闡明，但其在VSMC中的調節作用仍不明確。本研究采用RNA干擾技術，構建OPG過表達及OPGRNA干擾的腺病毒產品，感染HVSMC，檢測各組VSMC中OPG的表達情況以及VSMC凋亡情況，從而對OPG與VSMC凋亡之間的關系進行初步探討。
1、材料與方法
1.1材料HEK293細胞（美國菌毒種保管中心）。大腸桿菌DH5α及腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1，pYr-2.1-hU6OPG基因（pOTB7-OPG）（長沙贏潤生物技術有限公司，中國\\)。羊抗人OPG多克隆抗體及堿性磷酸酶標記的驢抗羊IgG（SantaCluz公司，美國）。MULV逆轉錄試劑盒、限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、T4DNA聚合酶等（NewEnglandBiolabs公司，美國）。小量質粒提取試劑盒（上海生工公司，中國）。Hoechst33258染色試劑盒及AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基公司，中國）。凍存HVSMC細胞由湘雅二醫院內分泌科謝輝博士惠贈。
1.2方法
1.2.1PCR擴增OPG基因以pOTB7-OPG載體為模板，PCR擴增OPG基因。引物對：OPG-f：5'-CGGGATCCGCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTG-3'BamHIOPG-r：5'-GGAATTCGGCCATTTCCAGTTATAAGCA-3'EcoRI。預計擴增片段大小為1.2kb,1%瓊脂糖凝膠電泳，回收OPG條帶。
1.2.2針對OPG基因siRNA序列的確定和合成通過Ambion尋找OPG的siRNA靶點靶序列并設計對應的寡核苷酸序列，根據OPG的基因序列和二級結構，篩選出3對特異性siRNA，根據siRNA設計原則綜合考慮，選擇第三條靶序列:正義鏈5’-GCTCAGTTTGTGGCGAATAAA-3’，反義鏈5’-TTTATTCGCCACAAACTGAGC-3’，以上述靶序列為基礎，設計OPG-shRNA引物。
1.2.3重組表達質粒的構建及鑒定。分別將OPG的PCR產物及OPG-shRNA片段轉載至腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1和pYr-2.1-hU6上，挑取克隆，用BamHI、EcoRI做雙酶切鑒定。選取酶切鑒定正確的克隆送去測序，以進一步確認此質粒為腺病毒骨架載體，并且已經成功插入OPG及OPG-shRNA目的基因。
1.2.4VSMC培養及鑒定。凍存VSMC復蘇后培養于含100ml/L胎牛血清的培養基中，置于37℃，50ml/LCO2細胞培養箱中培養。經平滑肌細胞特異性鼠抗人α-actin單克隆抗體免疫組化鑒定后，證實為VSMC，實驗用4~8代細胞。
1.2.5腺病毒感染VSMC細胞。將VSMC分為空白對照組、OPG過表達組、OPG過表達+OPGRNA干擾組。將VSMC以1×106接種于50ml的培養瓶中，24h后用腺病毒感染細胞。孵育48h后，消化、離心、收集細胞。
1.2.6RT-PCR。按常規方法提取總RNA,逆轉錄成cDNA。OPG引物（366bp）:上游引物序列5’-CCGGAAACAGTGAATCAACT-3’；下游引物序列5’-CCACTTTCTTTCCCGGTA-3’。GAPDH引物（452bp）：上游引物序列5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；下游引物序列5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。PCR循環：94℃5min,94℃20s,52℃25s,72℃25s，共30個循環，72℃末次延伸3min。取PCR產物9μl,加1μl溴酚藍,1.5%Agrose凝膠電泳30min\\(100V，35mA\\),紫外燈下觀察DNA條帶,拍照。
1.2.7Western-blot。參照《分子克隆實驗指南》的方法提取細胞總蛋白?？捡R斯亮藍定量總蛋白后，于10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。待電泳完畢后24V電轉印16h至PVDF膜，在室溫下封閉2h。加入鼠抗人OPG單克隆抗體，37℃孵育1h。
二抗為羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，二氨基聯苯胺顯色，數碼照相。
1.2.8Hoechst33258染色。將HVSMC細胞接種于6孔板，接種密度為1×106個/孔，24h后用腺病毒感染細胞。孵育48h后，按Hoechst33258試劑盒說明書進行染色。
1.2.9流式細胞術檢測。各組細胞培養48h后，經0.2％胰酶處理，離心收集細胞，用4℃預冷PBS洗滌2次，然后用250μl緩沖液重懸細胞，調整其濃度為1×106個/ml。取100μl細胞懸浮于5ml流式管中，加入5μlAnnexinV/FITC和10μl20ug/ml的碘化丙錠溶液，混勻后室溫避光孵育15min，然后加緩沖液至500μl，流式細胞儀分析，獲得細胞凋亡數據后用ModFitLT軟件進行細胞凋亡相對定量分析。
2、結果
2.1OPG及OPG-shRNA重組腺病毒的鑒定。經BamHI、EcoRI做雙酶切，pAd-OPG重組質粒切出約600bp的目的條帶（見圖1），shRNA重組質粒切出約470bp的目的條帶（見圖2），符合預期，說明重組腺病毒rAd-OPG及rAd-OPG-shRNA包裝成功。
2.2RT-PCR結果?？瞻准毎M中，OPG表達量比較弱。OPG過表達組中，OPG表達量大大增加。
在OPG過表達+OPGRNA干擾組中，由于OPG表達受到抑制，OPG表達量下降較明顯（見圖3）。用分析軟件Phoretix1D對各條帶進行灰度分析，結果顯示：與空白細胞組相比，OPG過表達組的OPG表達量增加；在OPG過表達+OPGRNA干擾組中，OPG-shRNA的干擾率達到73.9%，有效地抑制了OPG基因的表達（見表1）。
2.3Western-blot結果。腺病毒感染VSMC后OPG蛋白表達結果顯示,空白細胞組中OPG表達量比較弱。OPG過表達組中，OPG表達量大大增加。OPG過表達+OPGRNA干擾組中，由于OPG表達受到抑制，OPG表達量下降較明顯（見圖4）。用分析軟件Phoretix1D對各條帶進行灰度分析（見表2），結果顯示：與空白細胞組相比，OPG過表達組的OPG表達量增加；在OPG過表達+OPGRNA干擾組中，OPG-shRNA的干擾率達到67.7%，有效地抑制了OPG蛋白的表達。
2.4Hoechst33258染色。Hoechst染色時，細胞核呈致密濃染，比正常核??；或呈碎塊狀致密濃染，亮度較正常細胞要高，出現典型的凋亡小體。OPG過表達+OPGRNA干擾組中有一部分細胞發生了凋亡，不過數量較少。而OPG過表達組中有大量細胞發生了凋亡（見圖5）。
2.5流式細胞術檢測結果。OPG過表達組的細胞凋亡率較空白細胞組有較大增加，而進行RNA干擾后，細胞凋亡率有一定程度下降（見圖6）。結果顯示，OPG的表達和VSMC凋亡之間存在正比關系。各組間生存細胞和凋亡細胞比率見表3，直方圖見圖7。
3、討論
VSMC作為腹主動脈中膜的主要細胞成分，對維持動脈壁結構和功能的完整性起到了重要作用。最近越來越多的學者注意到腹主動脈瘤（abdominalaorticaneurysm,AAA）組織中VSMC數量減少是AAA形成過程中不可忽視的因素。目前已經有大量研究證實OPG與人類心血管疾病之間存在一定的關系。盡管OPG在骨代謝過程中的作用已經被逐步闡明，但其在VSMC中的調節作用仍不明確。
有研究發現無論是人體AAA組織還是AAA動物模型，OPG水平升高的同時伴有VSMC數量的減少，提示OPG水平與VSMC的凋亡呈正相關，然而，究竟是因為OPG的升高加速VSMC的凋亡還是VSMC的凋亡發生后促使OPG表達增高仍不清楚。因此弄清楚OPG基因表達與VSMC凋亡之間的關系有重要的臨床意義，有可能為AAA的基因治療提供一種新的思路。
基因研究包括兩個方面，基因過表達和基因表達的抑制。本研究通過OPG基因過表達及OPG基因的RNA干擾，即正反兩方面來探討其與VSMC凋亡之間的關系。RNA干擾技術作為一種十分有潛力的基因功能研究和基因治療方法，目前已成為抗病毒、抗腫瘤、基因表達調控、基因功能研究、基因治療等領域一個重要的研究方向和熱點?？瞻讓φ战M、OPG過表達組、OPG過表達+OPGRNA干擾組等各組細胞樣本的RT-PCR及Western-blot結果顯示：空白對照組中，OPG表達量較弱；OPG過表達組中，OPG表達量大大增加；OPG過表達+OPGRNA干擾組中，由于OPG表達受到抑制，OPG表達量下降較明顯。以上結果充分說明重組腺病毒rAd-OPG-shRNA具有特異性抑制VSMC目的基因OPG的作用。對各組細胞樣本進行Hoechst33258染色和流式細胞術分析，結果顯示OPG過表達組可見大量高亮度的凋亡細胞出現，而OPG過表達+OPGRNA干擾組只有一部分細胞發生凋亡。與空白對照組相比，OPG過表達組的細胞凋亡明顯，而OPG過表達+OPGRNA干擾組的細胞凋亡率與空白對照組細胞凋亡率相差不大。
流式細胞術分析結果顯示：空白細胞組凋亡細胞占10.06%，OPG過表達組凋亡細胞占33.82%，而OPG過表達+OPGRNA干擾組凋亡細胞占19.71%，說明OPG過表達組的細胞凋亡率較空白細胞組有較大上升，而同時進行RNA干擾后，細胞凋亡率有一定程度下降。以上結果分別從細胞和蛋白水平驗證了OPG基因表達與VSMC凋亡之間存在一定正比關系。OPG基因表達上調，則VSMC細胞凋亡率上升；而通過RNA干擾手段將OPG基因表達下調后，則VSMC細胞凋亡率具有一定程度的下降。
作為抑制基因表達的一種重要手段，RNA干擾近年來在基因治療領域的應用越來越多。RNA干擾可能被用來治療由于基因過度表達或異?；虮磉_引起的疾病。本研究表明，OPG基因的過表達可引起VSMC細胞凋亡。OPG表達與VSMC凋亡具有相關性，可能對動脈瘤形成有一定的作用。但是OPG的表達上調所導致的VSMC凋亡程度是否足以導致AAA的發生以及OPG的RNA干擾能否直接有效地抑制VSMC的凋亡仍需要進一步的動物實驗驗證以及后續研究。下一步可以考慮將RNA干擾應用于AAA的動物模型中，通過導入特異性抑制OPG基因表達的siRNA，降低OPG基因的表達量，防止VSMC凋亡，維持中膜結構的穩定性，觀察其是否能對AAA起到減緩發展速度的作用。
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