人骨髓間充質干細胞\\( bone marrow mesenchy-mal stem cells，BMMSCs\\) 具有較強的增殖和多向分化潛能，相較于胚胎干細胞、臍血干細胞和神經干細胞，其倫理學限制較少，有利于基礎和臨床研究的大范圍開展，且 BMMSCs 自體移植免疫原性更低，可作為良好的供體與宿主細胞進行更好的整合，是治療 中 樞 神 經 系 統 疾 病 的 理 想 載 體。但BMMSCs 在骨髓細胞中所占比例較小，且分化細胞存活時間較短。本研究旨在建立成熟的細胞培養模型，以 獲 得 大 量 純 度 較 高 的 BMMSCs，并 提 高BMMSCs 向 神 經 細 胞 分 化 后 的 存 活 時 間，為BMMSCs 的臨床應用提供實驗基礎。
1 材料與方法
1． 1 骨髓采集 選取 2005年 6 月在鄭州大學醫學院第一附屬醫院門診因不明原因發熱就診的患者 5例，其中男 2 例，女 3 例，年齡 20 ～ 51 歲，平均\\( 36. 40 ±11． 61\\) 歲。無菌條件下用骨髓穿刺針在髂骨處抽取骨髓，每例 3 ～5 mL，置于 4 ℃抗凝管中備用?；颊邔嶒炛橥?。
1． 2 主要試劑與儀器 Dulbecco's 改良 Eagle 培養基\\( Dulbecco' s modified Eagle' s medium，DMEM/F12\\) \\( 美國 Gibco 公司\\) ，胎牛血清\\( fetal bocine ser-um，FBS\\) \\( 美國 Hyclone 公司\\) ，β-巰基乙醇\\( β-mer-captoethanol，BME\\) 、3-丁基-4-羥基茴香醚\\( 3-tert-bu-ty-4-hydroxyanisole，BHA\\) 、二甲基亞砜\\( dimethylsul-foxide，DMSO\\) 、腦源性神經生長因子\\( brain-derivedneurotrophic factor，BDNF\\) 、牛血清蛋白\\( bovine ser-um albumin，BSA\\) \\( 美國 Sigma 公司\\) ，淋巴細胞分離液\\( 天津森潤生物技術有限公司\\) ，磷酸鹽緩沖液\\( phosphate buffer solution，PBS\\) \\( 北京康為世紀生物科技有限公司\\) ，山羊抗人神經元特異性烯醇化酶\\( neuron specific enolase，NSE\\) 多克隆抗體、異硫氰酸熒光素\\( fluorescein isothiocyanate，FITC\\) 標記兔抗山羊二抗\\( 北京中杉生物技術有限公司\\) 。倒置顯微鏡\\( 日本 Olympus 公司\\) ，細胞培養箱\\( 美國 Thermo 公司\\) ，高速離心機\\( 上海安亭科學儀器廠\\) ，醫用凈化工作臺\\( 蘇州高新凈化工程有限公司\\) 。
1． 3 BMMSCs 分離培養 用無菌 PBS\\( pH = 7． 2\\)將抗凝骨髓 1∶1 稀釋混勻，再 1∶1 等體積疊加到淋巴細胞分離液上，1 800 r·min－ 1離心 20 min。Pasteur 吸管吸取單核細胞層，PBS 洗滌后加入含體積分數 15%FBS 的 DMEM/F12 完全培養液，調整細胞密度至 1 × 109L－ 1，接種于培養瓶，37 ℃ 體積分數 5%CO2細胞培養箱培養。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。
1． 4 BMMSCs 傳代培養 原代細胞\\( P0\\) 貼壁生長達 80%融合時加入 37 ℃質量分數 0． 25%的胰蛋白酶1 mL 消化貼壁細胞。待細胞收縮變圓，細胞間隙不斷增大，加入含 FBS 的 DMEM/F12 培養液終止消化。Pasteur 吸管吹打使貼壁細胞完全懸浮，PBS 洗滌后，加入 DMEM/F12 完全培養液置培養箱中傳代培養。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。
1． 5 BMMSCs 分化培養 選第 4 代細胞\\( P4\\) 以1 × 108L－ 1細胞密度接種于培養瓶和 6 孔板中\\( 孔中預置用多聚賴氨酸處理的蓋玻片\\) ，待細胞生長達到80% 融合時棄去培養液，誘導組加入含體積分數 20%FBS 預 誘 導 劑 \\( DMEM / F12 + 1 × 10－ 3mol · L－ 1BME + 50 μg·L－ 1BDNF\\) ，24 h 后去除預誘導劑，再加入含體積分數 2% DMSO 誘導劑\\( DMEM/F12 +1 × 10－ 3mol·L－ 1BME + 2 × 10－ 4mol·L－ 1BHA +50 μg·L－ 1BDNF\\) 進行誘導。對照組不加預誘導劑和誘導劑。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。
1． 6 免疫熒光細胞化學染色 分化細胞進行 NSE免疫熒光染色。取生長有細胞的蓋玻片，體積分數4% 多聚甲醛固定 10 min，體積分數 3% H2O2室溫孵育 10 min，體積分數 5%BSA 封閉 10 min，加入山羊抗人 NSE 多克隆抗體\\( 1∶200\\) ，并設陰性對照，用 PBS 代替一抗，4 ℃ 過夜，37 ℃ 孵育 2 h，然后在避光條件下，加入 FITC-標記兔抗山羊二抗，37 ℃孵育 40 min 后熒光封片劑封片。
1． 7 細胞增殖活性的測定 收集不同發育階段的細胞，分為對照組和誘導組。誘導前 P4BMMSCs 為對照組，誘導分化細胞為誘導組。誘導組又分為誘導 1 d 組\\( 誘導分化第 1 天細胞\\) 、誘導 2 d 組\\( 誘導分化第 2 天細胞\\) 和誘導 3 d 組\\( 誘導分化第 3 天細胞\\) 。將 4 組細胞進行碘化丙啶染色: 細胞經 PBS洗滌，用體積分數 70%的乙醇固定，500 μL ＲNaseA酶緩沖液\\( 100 mg·L－ 1ＲNaseA + 20 mg·L－ 1碘化丙啶\\) 避光染色 30 min。用流式細胞儀分析細胞周期變化。每組計數 10 000 個細胞。
1． 8 統計學處理 應用 SPSS 13． 0 軟件進行統計分析，計量資料以均數 ± 標準差\\( x珋 ± s\\) 表示，組間比較采用 t 檢驗，P ＜0． 05 為差異有統計學意義。
2 結果
2． 1 BMMSCs 的分離和傳代培養 骨髓離心獲得單個核細胞接種培養 72 h 后，可見有少許細胞開始貼壁生長，其胞體狹長，散在分布\\( 圖 1A\\) 。7 ～9 d，部分長梭形細胞增殖形成集落，未貼壁細胞在連續換液中被不斷清除。15 ～ 20 d，梭形細胞呈極性或旋渦狀排列，形態一致\\( 圖 1B\\) 。傳代后，細胞增殖旺盛，其形態保持梭形無變化。隨傳代次數增加，BMMSCs 得到不斷純化和擴增。
2． 2 BMMSCs 的分化培養及鑒定 對 BMMSCs 進行誘導，加入預誘導劑 24 h 后，梭形細胞折光性降低。加入誘導劑 2 h 后即可見其胞體開始向細胞核方向收縮，并伸出較短突起。6 h 后胞體收縮呈圓形，折光性強，細胞突起繼續延長，類似于神經元軸突的單個長突起，呈典型神經元的形態\\( 圖 2\\) 。細胞誘導 4 ～10 h，對分化細胞固定進行 NSE 免疫熒光染色，陽性細胞呈綠色熒光\\( 圖 3\\) 。
2． 3 細胞增殖活性的測定 將 S + G2/ M 期的細胞百分比作為增殖指數\\( proliferation index，PI\\) 判定細胞增殖活性。結果顯示，誘導前 P4細胞\\( 對照組\\) PI較高，說明細胞增殖旺盛，增殖能力較強。與對照組比較，誘導后的細胞發生 G0/ G1期阻滯，各誘導組 S期細胞比例及 PI 均顯著降低\\( P ＜0． 01\\) ，說明細胞增殖明顯抑制。而各誘導組之間細胞比例無明顯變化\\( P ＞0． 05\\) ，說明細胞處于較穩定的存活及分化狀態; 見表 1。
神經退行性疾病的功能恢復是醫學界急需解決的難題之一，BMMSCs 增殖與分化研究為臨床治療提供了新思路。但 BMMSCs 在骨髓細胞中所占比例較小，如何分離獲得 BMMSCs 并在體外大量擴增，是進行 BMMSCs 相關研究和臨床治療的關鍵。本研究通過密度梯度離心獲得含有 BMMSCs 的單核細胞懸液，經多次連續傳代，獲得大量增殖旺盛的長梭形 BMMSCs。細胞周期檢測顯示 P4細胞\\( 對照組\\) PI 較高，說明細胞增殖活性較強，處于較活躍的DNA 合成和分裂期，表明分離培養的 BMMSCs 具有良好持續增殖和穩定傳代能力，細胞的形態特點和克隆增殖能力與 Jung 等報道基本相同。
本研究采用改良的化學誘導法，以 DMSO 和BHA 為基礎誘導劑，聯合 BDNF 將 BMMSCs 定向誘導為神經元細胞，分化后的細胞具有典型神經元的形態。免疫熒光染色結果也顯示多數分化的細胞表達 NSE，本實驗室以往研究已經證實 BMMSCs 能高效分化為神經元樣細胞，與 Woodbury 等結果一致。另外，誘導劑中存在的 BDNF 是神經營養因子家族中的重要成員。研究表明，機體發育期 BD-NF 對神經元存活及誘導分化有重要作用，而且對成體神經元再生修復也起保護作用。結果顯示，細胞分化各階段，各誘導組之間細胞周期比例無明顯變化，細胞處于較穩定的存活及分化狀態，說明 BD-NF 發揮了神經細胞的保護作用，對誘導生成的神經元樣細胞具有較好的營養作用，能防止分化細胞受損死亡。結果說明本實驗室能高效穩定地誘導BMMSCs 向神經細胞定向分化。當然，BMMSCs 向神經細胞分化的過程涉及細胞自身多種特異性基因的多個步驟的調控，其確切誘導機制還需進一步研究。
總之，本研究采用密度梯度離心法結合貼壁培養法，在體外分離擴增和純化 BMMSCs，并成功誘導其分化為神經元樣細胞。但分化的神經元樣細胞是否具有一定的電生理特性，移植到體內后是否可以存活，與體內神經元是否能建立突觸聯系等問題，將是下一步深入研究的方向。
參考文獻:
［1］ 王昭霞，鄒亞偉，李敏敏，等． 急性淋巴細胞白血病患兒骨髓間充質干細胞對 K562 和 K562/AO2細胞耐藥的影響［J］． 實用兒科臨床雜志，2012，27\\( 19\\) : 1507-1510．
［2］ 高飛，袁正偉． 骨髓間充質干細胞在先天性脊柱裂胎鼠脊髓中的分化［J］． 實用兒科臨床雜志，2012，27\\( 11\\) : 870-872，888．
［3］ Camassola M，de Macedo Braga L M，Chagastelles P C，et al． Meth-odology，biology and clinical applications of human mesenchymalstem cells［J］． Methods Mol Biol，2012，879: 491-504．
［4］ 張新宇，付學鋒． 骨髓間充質干細胞定向分化移植對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的影響［J］． 新鄉醫學院學報，2012，29\\( 2\\) : 96-101．
［5］ Jung S，Sen A，Ｒosenberg L，et al． Human mesenchymal stem cellculture: rapid and efficient isolation and expansion in a defined ser-um-free medium［J］． J Tissue Eng Ｒegen Med，2012，6 \\( 5\\) : 391-403．
［6］ 邢瑩，白瑞櫻，鄢文海，等． 人骨髓間充質干細胞向神經細胞分化過程中 Notch 通路信號分子表達的變化［J］． 生理學報，2007，59\\( 3\\) : 267-272．
［7］ Woodbury D，Schwarz E J，Prockop D J，et al． Adult rat and humanbone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］． NeurosciＲes，2000，61\\( 4\\) : 364-370．
［8］ 孫萌萌，劉蘭芬． 腦源性神經營養因子 BDNF 與精神分裂癥的關聯性研究進展［J］． 精神醫學雜志，2011，24\\( 5\\) : 392-394．
