199 培養基是 Morgan 等于 1950 年開發的培養基，其廣泛應用于各類細胞的培養及相關病毒性疫苗的研發生產。Vero 細胞是世界衛生組織和我國生物制品規程認可的用于疫苗生產的細胞系。與其他細胞基質相比，Vero 細胞來源方便，無外源因子污染，對多種病毒敏感，病毒增殖滴度較高，是很多病毒的理想培養基質，廣泛應用于人和動物疫苗的生產。
Vero 細胞的生長狀態直接影響相關病毒性疫苗的生產效率和疫苗質量，因此，培養基的篩選顯得尤為重要。
本研究使用的改良M199培養基是以Gibco M199培養基為基礎，通過調整氨基酸等營養成分的配比而制成的培養基。本實驗通過比較改良 M199 培養基和進口 M199 培養基培養 Vero 細胞及狂犬病病毒的效果，以期獲得更適應 Vero 細胞高密度培養的培養基。
1 材料與方法
1. 1 細胞及病毒 Vero 細胞及狂犬病病毒 aG 株均由長春生物制品研究所有限責任公司提供。
1. 2 實驗動物 SPF 級昆明小鼠，雌性，55 日齡，體重 11 ～ 18 g，由長春生物制品研究所有限責任公司實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（吉）2011-0003。
1. 3 主要試劑 改良 M199 培養基由無錫市美迪生物制品有限公司提供；進口 M199 培養基由國外某公司提供；胰酶購自美國 Gibco 公司；新生牛血清購自武漢三利生物技術有限公司。
1. 4 細胞培養及形態觀察 取已長滿單層的 Vero細胞，加入 0. 25%胰酶消化，按 1 ∶ 6 傳代，以 6 ×104個 ／ ml 的密度接種于新的 T25 細胞培養瓶中，分別用含 5%新生牛血清的改良 M199 培養基和進口 M199 培養基，置 37 ℃恒溫培養箱中靜止培養。每隔 24 h 于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態。
1. 5 細胞計數與活力測定 細胞長成致密單層時，消化計數，共計數 3 次，取平均值；同時采用臺盼藍染色法測定細胞活力。細胞活力（%）= 活細胞數 ／（活細胞數 + 死細胞數）×100%1. 6 病毒接種及培養 細胞長成致密單層后，棄去培養液，分別加入含 1%新生牛生血清的改良 M199 培養基和進口 M199 培養基，再分別按 0. 1 MOI 接種狂犬病病毒 aG 株，置 33 ℃恒溫孵箱中靜止培養。
1. 7 病毒滴度的測定 病毒接種 48 h 后，每隔 12 h采樣，每隔 3 d 更換 1 次維持液。按照《中國藥典》三部（2010 版）規定，采用小鼠腦內滴定法測定狂犬病病毒滴度。
2 結 果
2. 1 不同 M199 培養基培養的 Vero 細胞的形態 倒置顯微鏡下觀察可見，使用改良 M199 培養基培養的Vero 細胞較進口 M199 培養基培養的 Vero 細胞形態更規則，皺縮死細胞也相對較少，見圖 1。
2. 2 不同 M199 培養基培養的 Vero 細胞的增殖情況與活力 兩種培養基培養 72 h 時，Vero 細胞均已長成致密單層，使用改良 M199 培養基培養的細胞密度平均值（5. 13 × 105個 ／ ml）高于進口 M199 培養基（4. 02 × 105個 ／ ml），細胞活力平均值（98. 53%）也高于進口 M199 培養基（96. 24%）。
2. 3 不同 M199 培養基培養的狂犬病病毒的滴度 檢測結果顯示，使用改良 M199 培養基培養狂犬病病毒，病毒增殖更快，滴度更高，峰值可達 109log LD50／ ml，明顯高于使用進口 M199 培養基培養的病毒滴度，見圖 2。
3 討 論
Vero 細胞是由世界衛生組織推薦用于生產人用生物制品的傳代細胞系，目前廣泛應用于規?；擞靡呙绲纳a，包括狂犬病疫苗和重組蛋白的生產。為了獲得高質量的病毒收獲液，首先需獲得高密度的細胞。與其他體外培養的哺乳動物細胞一樣，Vero 細胞的生長對環境條件的要求較高，因此，選擇合適的培養基十分重要。本實驗比較了改良 M199 培養基和進口 M199 培養基培養 Vero 細胞及狂犬病病毒的效果，發現改良 M199 培養基培養的Vero 細胞形態更規則，培養 72 h 即可長成致密單層，增殖倍數達 10 倍左右；以其作為維持液培養狂犬病病毒，病毒滴度也明顯高于使用進口 M199 培養基。
本實驗采用的是 T25 方瓶培養 Vero 細胞以及狂犬病病毒，而實際生產中現均已采用轉瓶或生物反應器規模，該改良 M199 培養基能否適用于高密度大規模 Vero 細胞及相關病毒的培養，尚需進一步驗證。
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