0引言
吸煙與很多疾病的發生密切相關，煙草中的尼古丁類有害成分可致皮膚松弛。吸煙引起的皮膚松弛表現為毛孔突顯、面部輪廓變模糊、皮膚松弛下垂等。尼古丁是煙草植物合成的雜環類水溶性生物堿，俗稱煙堿，易透過生物膜和血腦屏障而使人成癮。
人體通過口鼻和支氣管黏膜吸收尼古丁后，會出現如心跳加速、呼吸變快、血壓升高、精神狀況改變等癥狀。尼古丁的半衰期約為2h。
尼古丁是乙酰膽堿受體激動劑，經尼古丁型乙酰膽堿受體\\(nAChR\\)介導而發揮作用。nAChR是一種相對分子質量為290kDa的蛋白質，最初發現表達于神經肌肉間突觸;深入研究表明，整個外周和中樞神經系統以及非神經細胞均表達nAChR。nAChR具有一個特征性的同五聚體環結構跨膜區，環結構的中心為離子通道。已發現αl～αl0、βl～β4、γ、δ和ε等17種nAChR亞單位，它們的組成差異決定離子通道的功能。其中，αl0亞單位不能單獨形成功能受體，當其與α9組成型受體共同作用時，可產生強大的乙酰膽堿激發電流，表明αl0亞基可調節α9亞基型受體的生理學特性，兩種亞單位共同組成一個功能型受體。電生理學與免疫組化研究表明，人類神經纖維表達的nAChR主要由α3、α5或β4亞基的同五聚體組成。據報道，尼古丁可能通過激活α7膽堿受體而發揮保護神經的作用。此外，nAChR的表達并不局限于神經末梢，研究發現皮膚組織也表達nAChR和毒覃堿型乙酰膽堿受體\\(mAChR\\);人胚皮膚成纖維細胞\\(HumanEmbryonicFibroblast，hEF\\)表達特異性nAChR。
皮膚松弛是常見的皮膚衰老現象，可由自然因素和/或非自然因素引起。大量研究證實，皮膚松弛始于皮膚真皮的成纖維細胞特有的生物學特性改變;皮膚皺褶、皮膚變薄與真皮成纖維細胞生長異常密切相關。皮膚老化程度與吸煙量及吸煙持續時間正相關。尼古丁能改變成纖維細胞的組織重塑功能及nAChRs的結構和功能，從而引起皮膚細胞外基質中特定成分減少。香煙煙霧提取物和尼古丁對hEF的損傷效應的研究結果表明，香煙煙霧提取物可致hEF呈典型的損傷細胞形態，并抑制細胞生長和誘導細胞G1、G2期停滯;但是，微量尼古丁\\(低于1mmol/L\\)則可促進培養的hEF增殖。所以，目前尼古丁對hEF增殖的作用尚未明確。
hupo膽堿是尼古丁受體阻斷劑，它能與尼古丁受體結合而使尼古丁喪失對nAChR的刺激效應，是一種除極性肌松藥，hupo膽堿可阻斷神經細胞中nAChR表達而用作止痛藥和麻醉輔助劑。由琥珀酰氯和氯化膽堿在一定條件下反應制取的氯化hupo膽堿\\(SuccinylcholineChloride，SC\\)注射液是醫學上常用的一種骨骼肌松弛劑。然而，尚未證明SC能阻斷皮膚中nAChR的表達而緩解尼古丁的皮膚損傷作用。
本研究經分別分析尼古丁及其受體阻斷劑———氯化hupo膽堿對人胚皮膚成纖維細胞增殖的影響，旨在發現吸煙對皮膚成纖維細胞的損傷效應及氯化hupo膽堿的潛在效能，為深入研究氯化hupo膽堿的皮膚保護效應及其美容功效提供實驗依據。
1、材料與方法
1．1細胞培養
采用補充10%新生牛血清的DMEM培養基培養hEF\\(細胞株取自醫學遺傳學國家重點實驗室\\)，胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞、以10000個/100μL接種96孔板，分別加入不同濃度的尼古丁和氯化hupo膽堿培養。
1．2細胞增殖分析
本研究采用的噻唑藍\\(3-\\(4，5-dimethylthiazol-2-yl\\)2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT\\)比色法是常用的檢測細胞存活的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為非水溶性的藍紫色結晶甲臜\\(Formazan\\)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜\\(DimethylSulfoxide，DMSO\\)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等，具有靈敏度高、經濟適用等特點。
細胞種板后，設置正常生長的細胞為對照組，其余組按濃度添加:尼古丁\\(昆明伊普瑞斯科技有限公司\\)\\(共8個濃度\\):10－8、10－7、10－6、10－5、10－4、10－3、10－2和10－1mol/L;SC\\(上海旭東海普藥業有限公司\\)\\(共8個濃度\\):10－8、10－7、10－6、10－5、10－4、10－3、10－2和10－1mol/L;10－3mol/L尼古丁和SC\\(共5個濃度\\):10－6、10－5、10－4、10－3和10－2mol/L;10－7mol/L尼古丁和SC\\(共5個濃度\\):10－6、10－5、10－4、10－3和10－2mol/L;繼續培養24h。吸除每孔液體并用磷酸鹽緩沖液\\(PhosphateBufferedSolution，PBS\\)洗細胞一遍，再加入100μLPBS和20μL0．5%MTT溶液，作用4h。吸除每孔液體，各加入150μLDMSO，震蕩混勻10min。以對照組調零測A490;計算細胞存活率\\(實驗組A值/對照組A值\\)。
1．3數據分析設置平行組，重復6次，計量資料以平均值±標準差\\(x－±SD\\)表示。
2、結果
2．1尼古丁對皮膚成纖維細胞增殖的影響與對照組比較，hEF在10－8～10－6mol/L尼古丁作用下，存活率升高，說明該濃度尼古丁對hEF增殖具有促進作用;10－5～10－1mol/L尼古丁作用下，存活率明顯降低，說明該濃度尼古丁對hEF增殖具有抑制作用\\(見圖1\\)。
2．2氯化hupo膽堿對皮膚成纖維細胞增殖的影響僅10－8mol/LSC作用后hEF存活率遠低于對照組存活率，其余濃度SC作用后細胞存活率均與對照組無顯著差異。說明10－8mol/LSC對hEF增殖具有抑制作用;10－7～10－1mol/LSC對hEF增殖的影響不明顯，僅呈現隨著濃度增高其細胞增殖的促進作用增強的趨勢\\(見圖2\\)。
2．3氯化hupo膽堿對尼古丁作用的影響10－6～10－2mol/LSC與10－3mol/L尼古丁共同作用于hEF，僅10－4mol/LSC共同作用時細胞存活率大于10－3mol/L尼古丁單獨作用時的存活率。說明10－4mol/LSC能降低尼古丁對hEF增殖的抑制作用，而其余濃度SC卻與尼古丁協同抑制hEF增殖\\(見圖3\\)。10－6～10－2mol/LSC與10－7mol/L尼古丁共同作用于hEF，細胞存活率均小于10－7mol/L尼古丁單獨作用時的存活率，說明SC能減弱尼古丁對hEF增殖的促進作用\\(見圖3\\)。
3、討論
本研究采用MTT法依次檢測了尼古丁和SC對hEF增殖的影響，以及SC對尼古丁作用的影響。結果表明，高濃度尼古丁抑制hEF增殖;而低濃度尼古丁則促進細胞增殖，這種趨勢與錢革等采用尼古丁原代培養hEF以觀察其損傷效應的結果相符。臨床上用于維持肌松的SC濃度為\\(7．55～1．51\\)mmol/L，本實驗證明該濃度SC對hEF增殖無不良影響，因此可以作為尼古丁受體阻斷劑進行其對尼古丁作用的檢測。10－6～10－2mol/LSC能減弱尼古丁對hEF增殖的作用\\(抑制或促進\\)。其中，10－4mol/LSC能明顯緩解尼古丁對hEF增殖的抑制作用，且該濃度處于臨床上使用SC的濃度范圍內，提示了10－4mol/LSC可以用于緩解皮膚松弛。
在進一步分析SC對尼古丁作用的影響的實驗中，可加入正常培養的細胞作為對照組，以估測SC對尼古丁作用的強度。檢測SC是否能逆轉尼古丁的抑制作用而使hEF增殖由受損變為受益，或SC僅緩解尼古丁的抑制作用但仍使hEF增殖受損;檢測SC是否雖削弱尼古丁的促進作用但仍使hEF增殖受益，或SC能逆轉尼古丁的促進作用而導致hEF增殖受損?；谝延屑昂笃诔晒?，SC有望成為具有抗皮膚松弛的香煙添加劑成分，在特定濃度下發揮緩解尼古丁損傷皮膚作用的功效，為減少吸煙對人體皮膚的損傷提供新思路。
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