脊髓損傷（spinal cord injury,SCI）是脊柱外科一種致殘率很高的疾病，易造成患者運動功能障礙，大小便失禁甚至終身癱瘓[1].現代研究表明，脊髓損傷后，經歷第一次原發性損傷及第二次繼發性損傷，二次損傷是繼發性，是可以預防和治療的，其重點在于保護殘存神經元的功能[2].建立簡單、穩定、高效的神經元體外培養是在細胞水平研究脊髓損傷的重要物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 出生24h內SD乳鼠，雌雄不限，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 Neurobasal 培養基、B27 無血清添加劑、GlutaMAX-I添加劑、DMEM（high glucose）培養基、滅活胎牛血清、0.25%胰酶、臺盼藍染液均購自Invitrogen公司，多聚-D-賴氨酸、DPBS、Hank's液、抗熒光淬變封片液購自碧云天公司，DNase I、DAPI、Triton X-100購自sigma 公司，神經元相關微管蛋白-2（MAP2）、Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG（H+L）購自abcam公司。

1.1.3 主要器材 24孔細胞培養板、15mm細胞爬片、超凈工作臺、細胞培養箱、激光共聚焦顯微鏡、手術解剖顯微鏡

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 種植培養液：含90%DMEM+10%滅活胎牛血清。維持培養液：98%Neurobasal培養基+2%B27無血清添加劑+0.5mMGlutaMAX-I添加劑。

1.2.2 細胞爬片及細胞培養孔板處理 將滅菌的15mm細胞爬片用DPBS配制的0.1mg/mL多聚-D-賴氨酸溶液浸泡，室溫孵育2h,吸棄多聚-D-賴氨酸溶液，蒸餾水洗2遍，晾干待用。

1.2.3 海馬神經元的分離 取出生24h內SD乳鼠，75%酒精消毒后斷頭，依次剪開皮膚、顱骨，迅速取出腦組織置于冰上含有預冷Hanks液的培養皿中。在手術顯微鏡下分離出兩側的海馬區，徹底剝離腦膜及血管。用剪刀剪成約1mm3大小，加入預熱的0.05%胰酶，放入37℃消化15min（每7min稍微搖晃一下）。小心吸走消化過組織，用2mL 含 10%胎牛血清的 DMEM 培養基終止消化，加入100μLDNase I,混勻后使用 1mL 槍頭上下輕柔吹打 15下，靜置2min,吸取上清液。再像沉淀的組織團塊中加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養基及100μL DNase I,重復上述吹打步驟。吸取上層細胞懸液，如此重復2次。

70μm細胞篩過濾，1000r/min離心5min棄上清，使用種植培養基重懸，吸100μL細胞懸液后加入100μL臺盼藍染液，于血球計數器下計數細胞，調整細胞密度至2×105個/mL,每孔加入1mL,十字搖板數次，放入培養箱內。以上操作確保在2h內全部完成。4h后使用無血清DMEM培養基洗板鏡檢細胞碎片基本去除后，換成Neurobasal培養基，后每2d半量換液。

1.2.4 神經元細胞鑒定 取體外培養7d的海馬神經元細胞爬片，吸出培養基，PBS洗1次，加入1mL預熱多聚甲醛溶液，確保神經突不被破壞，室溫孵育10min.PBS洗1次，0.1%Triton X-100通透膜10min.加入10%山羊血清孵育1h后，加入1%血清稀釋的MAP2（1∶500），4℃濕盒孵育過夜。加入1%血清稀釋的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠 IgG（H+L）（1∶1 000），室溫避光孵育 1h.DAPI 復染5min后，將細胞爬片反轉放至滴有抗熒光淬滅封固液的干凈載玻片上。避光干燥后使用透明指甲油密封載玻片邊緣，激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 細胞形態的觀察 剛接種細胞分散，呈圓形透亮。

4h后細胞已貼壁，部分細胞已伸出短小軸突。1~2d后，細胞明顯增大，突起延伸，形成稀疏網絡。在培養過程中，神經元之間的纖維聯系逐漸豐富，并形成網絡。5~7d神經元在倒置顯微鏡下可見具有明顯的光暈，此時神經元胞體呈三角形、橢圓形或多邊形，邊界清楚，胞體明亮，立體感增強（圖1、圖2）。2.2 神經元的鑒定 第7天海馬神經元固定、封閉后行MAP2免疫熒光染色，結合DAPI核染色，高倍鏡下，可見神經元胞體呈多邊形，樹突、軸突明顯（圖3、圖4、圖5）。

3 討論與結論

神經元是腦及脊髓組織中最基本的組成成分，對神經系統功能的發揮著主要的作用，是腦及脊髓損傷中最常用的細胞，其培養和鑒定技術亦是神經生物學研究中最基本的技術。但是連續的神經元細胞系因無法形成典型的軸突、樹突及突觸而得不到廣泛應用，而原代培養的神經元比傳代細胞系更加接近在體狀態，是研究工作中較佳的目的細胞，得到了廣泛應用。

理論上，原代神經元的培養可通過大腦任何部位及脊髓獲取，但海馬部位較其他部位神經細胞成分簡單，含量多，擁有典型的細胞表型[3-4].傳統方法多采用胎鼠進行海馬神經元的培養[5-6],其神經分化程度低，便于培養，但由于操作復雜，如進行雌雄鼠配種，計算胎齡，實驗時間不可控制，取材時胎鼠表面羊水過多，海馬較小等導致操作要求高。而采用乳鼠較胎鼠具有較多的優點，可按照實驗按需處死一至數只實驗乳鼠，取材較胎鼠簡單，無需擔心缺氧對胎鼠腦神經元的損害。

在海馬神經元培養的過程中，很多因素都會影響原代海馬神經元培養的質量，如收集細胞過少，接種時死細胞比例過高，雜細胞過多等，其對實驗條件的要求較普通細胞更高。首先，除了消化以外，其他操作均在冰上操作，從解剖至接種細胞控制在2h內完成，盡量減少組織細胞代謝。解剖時，在手術顯微鏡下盡可能去除海馬組織表面所有的血管膜，以免消化后被迫吹打，導致接種時死細胞及雜細胞比例過高。其次，組織在消化前用剪刀剪碎，并使用低濃度0.05%胰酶加適量DNA酶，作用時間控制在15min左右，低濃度胰酶消化能力相對溫和，死細胞較少，從而避免使用木瓜酶現用現配的缺點。DNA酶可分解消化過程死細胞釋放出來的DNA,避免組織纏結，吹打過程可收獲更多單細胞懸液。吹打時，采用分步吹打，慢吸慢吹，動作輕柔，保證每一個單細胞都避免過度吹打，盡可能多地收集細胞。再次，使用含10%滅活胎牛血清重懸、接種細胞，其血清成分可促進細胞生長、增殖，4h后換成含B27添加劑的Neurobasal培養基，換液前輕微震蕩，可將多數貼壁不牢固的膠質細胞及細胞碎片去除。

含B27添加劑的Neurobasal培養基其成分確定，培養出的細胞狀態均一，選擇性促進神經細胞生長，而膠質細胞幾乎不分裂。最后，接種板也是決定實驗成敗的關鍵因素，接種板密度過低，神經元突觸形成過少，無法利用自身分泌促生長因子，同時膠質細胞分裂過多，難以存活和成熟。密度過高，營養相互爭奪，細胞容易抱團生長，均會導致實驗失敗。本實驗膠質細胞含量較少，未使用阿糖胞苷抑制膠質細胞生長，因阿糖胞苷加入時間及劑量難以控制，毒性較大，除了抑制膠質細胞外，對正常海馬神經元亦有毒害作用。

綜上所述，采用低濃度胰酶消化，差速貼壁及無血清培養新生SD乳鼠海馬神經元的方法簡單、穩定、高效，可得到高密度的符合體外實驗要求的細胞，為神經系統損傷的研究提供了良好的目的細胞。