近年來, 我國酸雨問題日益嚴重, 已成為繼歐洲和北美之后的全球第三大酸雨重災區, 受酸雨影響的地區占國土面積的40% \\(麥博儒等2010\\)。
研究表明, 酸雨會嚴重影響生態系統的物質循環和能量流動, 酸雨危害所引起的經濟損失和對生態平衡及植物本身影響的嚴重性已越來越引起人們的關注\\(謝小贊等2009; 金清等2009\\)。從已有文獻看, 針對酸雨對植物影響的研究大多集中于雌雄同株植物, 極少涉及雌雄異株植物。據報道, 雌雄異株植物在全世界約有14 620種, 隸屬于被子植物的959個屬, 是陸地生態系統的重要組成部分\\(Renner和Ricklefs 1995\\)。由于繁殖成本的不同,該類植物的雌、雄個體在形態特征、生理生化特征、資源配置和環境適應性等方面已表現出明顯的性別差異\\(胥曉等2007\\)。
眾多學者對雌雄異株植物的研究表明, 在養分貧瘠、生境惡劣或未受人為因素干擾的情況下,某些物種雄株個體數量較多, 生長良好; 但在土壤肥沃、生境良好或受到人為因素干擾的環境中,雌株生長良好, 具有性比優勢\\(胥曉等2007; 尹春英和李春陽2007; Xu等2010\\)。我們通過總結前人的研究成果發現, 逆境下大多數物種雄株的凈光合速率比雌株偏高, 而這些研究對象主要涉及到被子植物, 有關裸子植物的研究甚少。金靜等\\(2008\\)對20種裸子植物和102種被子植物的光合能力進行比較發現, 裸子植物的光合能力普遍弱于被子植物, 且成年和幼年銀杏雌性個體的光合能力強于雄性個體\\(蔣雪梅等2013\\)。這是否表明裸子植物與被子植物在抗逆性方面可能存在差異, 且裸子植物銀杏雌株的抗逆能力可能強于雄株, 這些問題都有待進一步探究。
銀杏, 裸子植物, 雌雄異株, 是現存種子植物中最古老的刁遺植物, 有“金色活化石”之稱。銀杏集食用、藥用、保健、化妝、用材、綠化、觀賞于一體, 具有較高的經濟價值和生態效益\\(曹福亮2002\\)。研究還表明, 銀杏的抗酸性較強, 是最近篩選出的新抗酸樹種\\(胡曉梅2010\\)。為了抵抗酸雨脅迫, 重慶范圍內大量種植銀杏, 效果顯著。因此本文以人工種植的銀杏雌、雄幼苗作為試驗材料,模擬酸雨脅迫對銀杏雌、雄幼苗生長及生理特性的影響, 試圖了解銀杏雌、雄幼苗生長參數、抗氧化酶活性、光合色素和生化物質含量在酸雨脅迫下的響應差異, 從而揭示銀杏雌、雄幼苗在抗酸性方面是否存在差異及耐酸閾值, 這也有助于為更好地研究銀杏生存歷史和如何保護銀杏、改善生態環境提供理論參考。
材料與方法
1、 研究區概況
試驗地位于四川省南充市郊的西華師范大學生命科學學院試驗基地內。南充市地處北緯30°35'~31°51', 東經105°27'~106°28', 整個區域屬亞熱帶濕潤型季風氣候, 年均溫15.8~17.8 ℃, 年平均降雨量約980~1 150 mm, 年均相對濕度76%~86%。
2、 材料與試驗設計
2.1 試驗材料
試驗材料由2008年初當地園林公司提供的二年生銀杏\\(Ginkgo biloba L.\\)實生苗, 植株的雌雄性別采用溴麝香草酚藍法進行鑒定\\(龍程和潘瑞熾1991\\)。鑒定方法具體為: 取大約0.1 g潔凈葉片, 加入3 mL蒸餾水研磨成勻漿, 后吸取一定量的上清液, 加入其4倍的0.1%溴麝香草酚藍溶液混勻觀察,若混合液呈黃褐色為雌株提取液, 混合液仍呈綠色則為雄株提取液。鑒定完后從幼苗中各選取40株高度、長勢基本一致的植株, 分雌、雄移栽至內徑30 cm、深25 cm的花盆中, 每盆土壤重量控制為8 kg并施加緩效肥12 g \\(13% N、10% P、14%K\\), 做好各種管理措施, 讓其自然生長。
2.2 模擬的酸雨配置
模擬酸雨為硫酸型\\(VSO42-: VNO3-=8:1\\), pH=3.8~4.0, 依據南充酸雨環境監測數據, 利用H2SO4\\(98%\\)與HNO3\\(75%\\)按8:1 \\(V/V\\)配置成酸雨母液, 用PHS-3TC精密數顯酸度計\\(上海天達儀器公司\\)進行準確校正, 用自來水稀釋配置成pH=3.0、4.0、5.0和5.6的4種酸雨溶液, 分別代表不同程度的酸雨脅迫和對照處理。
2.3 試驗設計
試驗采用完全隨機設計, 2性別\\(雌、雄\\)×4酸梯度\\(5.6、5.0、4.0、3.0\\)。待2008年初移栽后的銀杏幼苗長勢完全穩定后, 于2009年6月10日將所有待處理幼苗全部移入4周通風頂部遮雨的大棚內培養, 次日分別對其進行不同濃度的模擬酸雨脅迫處理試驗。每種性別的銀杏幼苗隨機分成4組, 每組10株。用小型噴霧器在對應植株葉片的正反面分別噴灑pH為5.6、5.0、4.0和3.0的等量模擬酸雨溶液, 每次均噴至葉片滴液為止。噴灑實驗每隔5 d進行一次。為防止盆栽銀杏土壤干旱,每周對所有試驗幼苗澆灌一次等量的Hoagland溶液保持土壤濕度適中。處理時間持續3個月, 整個試驗過程除每組噴施的酸雨濃度不同外, 其余環境條件完全保持一致。
2.4 測定指標與方法
2.4.1 生長及形態方面的測定 雌雄銀杏幼苗基徑的測定采用數顯游標卡尺, 測定點距離土壤表層約5 cm并做好標記, 已便于實驗前后測定點為同一位置。葉片相對含水量的測定利用下列公式計算:葉片相對含水量=\\(FW–DW\\)/\\(SFW–DW\\)×100%\\(張鳴等2008\\), 其中, FW: 鮮重; DW: 干重; SFW: 飽和鮮重。比葉面積采用楊鵬和胥曉\\(2012\\)的方法:比葉面積=總葉面積/葉干重。葉面積的測定采用SHY-150型活體掃描式葉面積儀, 干重、鮮重及飽和鮮重的測定均采用ACCULAB電子分析天平。
2.4.2 生理生化指標的測定 隨機選擇各種處理下的雌雄植株各5株, 并選取各植株上部第3或4片完全展開的向陽葉片用于測定光合色素含量及比值、超氧化物歧化酶\\(superoxide dismutase, SOD\\)、過氧化物酶\\(peroxidase, POD\\)、過氧化氫酶\\(cata-lase, CAT\\)、抗壞血酸過氧化物酶\\(ascorbate perox-idase, APX\\)活性、丙二醛\\(malondialdehyde, MDA\\)、游離脯氨酸和可溶性蛋白質含量。
光合色素的提取: 準確稱取0.2 g鮮重葉片剪成細絲狀后放入潔凈試管中, 加入25 mL混合提取液\\(配比為V丙酮:V酒精=1:1\\), 封口后將試管置于暗處直至葉片顏色完全變白。酶提取方法: 取0.3 g葉片于預冷的研缽中, 加入6 mL預冷的緩沖液[磷酸緩沖液, pH 7.8, 含有1 mmol·L-1的乙二胺四乙酸和1%聚乙烯吡咯烷酮]研磨成勻漿, 于4 ℃下離心30min \\(12 000×g\\), 取上清液\\(酶液\\)用于試驗。
光合色素含量的測定采用紫外可見分光光度計\\(李合生2000\\)。SOD和POD活性的測定分別采用氮藍四唑比色法\\(Giannopolitis和Ries 1977\\)和愈創木酚法\\(Maehly和Chance 1954\\)。CAT和APX活性的測定通過Maehly和Chance \\(1954\\)以及沈文飚等\\(1996\\)的方法。MDA、可溶性蛋白質和游離脯氨酸含量的測定分別采用硫代巴比妥酸比色法\\(Kramer等2008\\)、考馬斯亮藍法\\(Bradford 1976\\)和茚三酮顯色法測定\\(Bates等1973\\)。
3、 統計分析
利用SPSS18.0統計軟件進行數據處理。平均值間的比較采用單因素方差分析方法\\(One-wayANOVA\\); 多重比較采用鄧肯多重范圍檢驗\\(Dun-can's multiple range test\\); 對性別與處理之間的交互作用采用多因素方差分析\\(multivariate analysis\\)。
實驗結果
1、 模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗葉片形態及地上部分生長狀況的影響
試驗現象表明, 在4種不同的處理條件下, 銀杏雌、雄幼苗間在葉片形態和地上部分生長狀況方面差異并不明顯。同對照相比, pH值為5.0的模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗的外部形態并沒有造成任何不良影響。然而隨著模擬酸雨pH值進一步低至3.0時, 雌、雄幼苗地上長勢逐漸變差, 出現某些可見傷害癥狀, 如葉片顏色由濃綠變淺, 繼而部分葉片出現少量黃點; 葉片面積也由大變小, 葉肉由厚變薄直至后來某些葉片葉緣開始卷曲。
2、 模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗株高和基徑增長量的影響
如圖1所示, 在4種不同條件下, 銀杏雌株幼苗的株高和基徑增長量均比雄株偏高?？傮w上, 模擬酸雨具有降低銀杏雌、雄幼苗株高和基徑增長量的趨勢, 且pH值越低, 株高、基徑增長量的降低程度越大。與對照相比, pH為5.0的模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗株高和基徑的增長并無明顯影響;而pH值為4.0和3.0時, 幼苗株高和基徑的增長量則顯著降低。
3、 模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗葉片相對含水量和比葉面積的影響
如圖2所示, 對照條件下, 銀杏雌株幼苗的葉片相對含水量和比葉面積均顯著高于雄株; 而在pH值5.0、4.0和3.0三種模擬酸雨處理下, 銀杏雌、雄幼苗間的葉片相對含水量和比葉面積差異并不明顯?？傮w上, 模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗葉片的相對含水量均有一定程度的降低, 而對雄株幼苗的比葉面積具有提高的趨勢; 與對照相比, pH值3.0的模擬酸雨顯著降低了銀杏雌、雄幼苗的葉片相對含水量, 提高了雌、雄幼苗的比葉面積。
4、 模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗光合色素含量和比值的影響
如表1所示, 對照條件下, 銀杏雌株幼苗葉片內的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量、類胡蘿卜素和葉綠素a/葉綠素b比值均略高于雄株, 但差異并不明顯; 在另外3種處理下, 銀杏雌株幼苗葉片內的葉綠素a和葉綠素總量也比雄株偏高?？傮w上, 在4種條件下, 雌、雄幼苗葉片間葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和葉綠素a/葉綠素b比值的差異均未達到顯著水平。同對照相比, 模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗葉片內的葉綠素總量和類胡蘿卜素含量均有一定程度的降低; 且pH值為3.0的模擬酸雨處理對雌、雄幼苗葉片內葉綠素a和葉綠素總量的降低水平達到了顯著差異。
5、 模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗各種抗氧化酶活性的影響
如圖3所示, 對照條件下, 除APX活性外, 銀杏雌株幼苗葉片內的SOD、POD和CAT活性均略高于雄株, 差異并不顯著; 在pH值5.0的模擬酸雨處理下, 銀杏雄株幼苗葉片的SOD和APX活性略高于雌株, 而在pH值為4.0和3.0兩種模擬酸雨處理下, 銀杏雌株幼苗的SOD、POD、CAT和APX活性略高于雄株, 但在pH值5.0、4.0和3.0三種模擬酸雨處理下, 雌、雄間各種酶活性的差異并未達到顯著水平?？傮w上, 隨著pH值的不斷降低, 銀杏雌、雄幼苗葉片內的SOD和CAT活性先緩慢升高,在pH值5.0時達到最高值, 之后均呈下降趨勢; 與對照相比, pH值為5.0和4.0的模擬酸雨對雌、雄幼苗SOD和APX兩種酶活性的影響并不明顯, 但pH值為3.0的模擬酸雨顯著降低了銀杏雌、雄幼苗POD、CAT和APX的活性。
6、 模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗丙二醛、游離脯氨酸和可溶性蛋白質含量的影響
如圖4所示, 在對照和pH值5.0模擬酸雨兩種處理下, 銀杏雌、雄幼苗間的丙二醛和可溶性蛋白質含量并無明顯差異; 而雄株葉片內的游離脯氨酸含量在4種不同條件下均顯著高于雌株?？傮w上, 隨著模擬酸雨濃度的遞增, 銀杏雌、雄幼苗葉片內丙二醛、游離脯氨酸和可溶性蛋白質含量逐漸增高; 與對照相比, pH值為5.0的模擬酸雨對銀杏雌、雄幼苗葉片內的丙二醛、游離脯氨酸和可溶性蛋白質含量的影響均不明顯, 而pH值為3.0的模擬酸雨顯著提高了銀杏雌、雄幼苗葉片內的丙二醛和游離脯氨酸含量。
討論
本試驗結果圖1和圖2-A表明, 銀杏雌、雄幼苗地上部整體長勢隨模擬酸雨濃度的升高而逐漸變差, 如葉片數量、面積、相對含水量和株高、基徑的增長量隨酸度增大而減少、變小、降低和變慢。在4種不同條件下, 銀杏雌株幼苗的增長量均略高于雄株幼苗。由此表明, 酸雨會影響植物的正常生長、阻礙生長發育、降低生長量和產量。當酸雨酸度超過植物的耐酸閾限時, 葉片會出現退綠、失水萎蔫、過早落葉和壞死斑等可見傷害癥狀, 并隨著酸度的遞增和淋溶時間的延長加劇受害程度\\(金清等2009; 謝小贊等2009; 胡曉梅2010\\), 且在同一酸度的模擬酸雨環境下, 銀杏雌株幼苗受到的傷害小于雄株。
由本文中表1的數據表明, 在4種模擬酸雨處理條件下, 銀杏雌株幼苗的葉綠素a和葉綠素總量測定值均略高于雄株。由此可知, 在4種情況下,銀杏雌株幼苗葉片的光合色素合成過程受到酸雨的影響較雄株受到的影響要小些。與對照相比,pH值為5.0、4.0和3.0的模擬酸雨在一定程度上對銀杏雌、雄幼苗葉片內的葉綠素總量和類胡蘿卜素含量有所降低, 且pH值3.0的模擬酸雨對雌、雄幼苗葉片內的葉綠素a和葉綠素總量的降低程度達到了顯著水平。這說明高濃度的模擬酸雨會嚴重破壞植物葉片的結構, 使得葉片受損, 進而影響到廣泛分布于葉片中的細胞器, 如葉綠體結構遭到破壞, 類囊體膜明顯扭曲, 干擾色素的正常合成,嚴重時還會加快原有色素的降解, 最終降低色素含量\\(肖艷等2004\\)。
王開峰等\\(2005\\)的研究表明, 在適度逆境條件下, 植物體內氧自由基含量的增加會誘導SOD活性上升, SOD通過歧化反應使超氧陰離子轉變為無毒的氧氣和毒性較低的過氧化氫, 而過氧化氫又被POD、CAT等酶進一步分解為水和氧氣。因此SOD、POD等保護酶在一定程度上能協同消除植物體內過多的氧自由基, 維持活性氧代謝平衡、降低其對膜脂的過氧化程度, 保護膜結構, 提高植物適應脅迫的能力。由文中圖3和圖4-A的數據結果表明, 銀杏雌、雄幼苗葉片內的SOD和CAT活性隨pH值的降低, 呈先升高, 在pH值5.0時達到峰值,后下降的趨勢; 而MDA含量則隨pH值的降低而不斷升高。與對照相比, pH為3.0的模擬酸雨顯著降低了POD、CAT和APX的活性, 提高了MDA含量。由此表明銀杏雌、雄幼苗經過pH值為3.0的模擬酸雨處理后, 其體內活性氧的產生和清除這一動態平衡過程已受到嚴重干擾, 其生成量已超過了抗氧化酶系統的清除能力, 從而使得細胞膜脂過氧化而產生了大量具有細胞毒性的物質如丙二醛等。
逆境下, 植物細胞還可通過積累大量可溶性滲透調節物質來維持細胞形狀、保持膜的通透性。在眾多的滲透調節物質中, 脯氨酸是唯一能淬滅單態氧、清除羥自由基、穩定蛋白質, 緩解植物免遭毒害的可溶性物質\\(王麗媛等2010\\)。對文中圖3和圖4數據進行分析發現, 在高濃度的模擬酸雨條件下, 雄株葉片內的抗氧化酶活性較雌株均偏低, 而MDA含量顯著高于雌株。在可溶性蛋白質和游離脯氨酸含量方面, 銀杏雌、雄幼苗葉片內其含量均隨酸雨濃度的遞增而不斷上升;且在pH值3.0的模擬酸雨條件下, 游離脯氨酸含量的提高幅度同對照相比達到顯著水平。由此可知銀杏雌、雄幼苗為了緩解酸雨帶來的傷害, 其葉片內可通過積累較多的游離脯氨酸來清除過多自由基, 降低膜脂過氧化產物; 同時游離脯氨酸和可溶性蛋白質等滲透調節物質的積累還可提高細胞的滲透勢, 保持膜的通透性, 維持細胞形狀, 提高植物的耐逆性?？傮w上, 從雄株較低的抗氧化酶活性、較高的膜脂過氧化主要產物MDA含量和能作為活性氧清除劑的脯氨酸含量得知, 雌株的代謝過程受到的影響比雄株要小些。
綜上所述, 隨著模擬酸雨濃度的不斷增加, 銀杏雌雄幼苗的地上部分可見傷害逐漸出現, 葉片含水量、光合色素含量和抗氧化酶活性逐漸降低,而滲透調節物質含量逐漸升高。與對照相比, 低濃度的模擬酸雨對上述測定值的影響并不明顯,而在pH為3.0的模擬酸雨處理后, 大部分測定值的變化幅度達到了顯著水平。由此表明, 銀杏雌、雄幼苗的耐酸閾值應在pH值4.0~3.0之間。盡管在上述4種處理條件下, 銀杏雌、雄幼苗在外部形態方面并無明顯差異, 但從各種生理生化指標的測定值進行比較, 銀杏雄株內部生理過程受到的干擾要大于雌株。這說明銀杏雌株的耐酸能力強于雄株。銀杏雌、雄幼苗在耐酸能力方面的差異可能是基因與環境因子共同作用的結果。因此要進一步探究其具體原因還需采用現代分子生物學方法和技術, 從雌、雄植株的分子遺傳水平進一步探究銀杏雌、雄個體抗酸性差異, 提高植株的耐酸性。
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