西洋參\\(Panax quinquefolium L.\\)為五加科人參屬多年生重要的栽培藥材，在田間生產中連作障礙十分嚴重，重茬栽種西洋參在第 2 年以后存苗率降至 30%以下。西洋參原產北美洲，我國適宜栽培西洋參地區僅限于吉林、遼寧、河北、山東等省的少數地區，連作障礙大大制約了西洋參產業的可持續發展。引起西洋參連作障礙的因子除了病原菌積累、土壤養分失調及物理性狀改變外，近年來發現化感作用也是重要原因之一?；凶饔肻\(Allelopathy\\)是指一種植物\\(供體\\)通過向環境釋放化學物質而對另一種植物或微生物\\(受體\\)所產生的直接或間接作用。已有報道表明 p-香豆酸廣泛存在于小麥、油松、毛白楊等多種植物根內并可分泌至土壤中，從而對他種植物或自身的生長產生化感/自毒作用，進而導致自然生態群落中植物結構變化或林木和農作物連作障礙。本課題組前期研究發現，在以濾紙片為基質的種胚生長實驗中，西洋參須根中含有的 p-香豆酸顯著抑制自身胚根生長，推測 p-香豆酸是西洋參自毒中起到重要作用的化感物質。

Kaur 等報道在植物自然生長環境中，土壤能夠對化感物質的活性產生干擾，導致化感作用強度發生改變，雖然目前檢測到 p-香豆酸在北京地區種植西洋參的土壤中含量為 0.462—0.985 mg/g，達到產生化感活性的濃度，但土壤中是否對西洋參種胚生長產生化感作用仍缺乏直接證據。另外，西洋參為宿根草本植物，生產上多采用育苗 2 年后倒栽的種植方式，那么明確 p-香豆酸是否對成株西洋參也具有自毒作用對于指導生產就有重要意義。如果對成株西洋參沒有抑制作用或作用較低，則可以考慮老參地用于西洋參苗的移栽連作，在理論上有助于探明多年生植物隨著生長年限的增加對化感物質的敏感性差異。

基于以上問題，本實驗以前期測定的老參地土壤 p-香豆酸含量為試驗設計依據，采用土壤基質進一步明確 p-香豆酸在土壤自然環境中對西洋參種胚生長的影響；并選擇 2 年生西洋參種根，通過水培試驗探討p-香豆酸對成株西洋參生長的直接作用及其生理機制。

1、 材料和方法

1.1 植物材料

供試的西洋參種子由北京天惠藥業西洋參公司提供，種子已完成后熟。2 年生出苗前的西洋參種根于2010 年 4 月采于北京市延慶區古城鎮西洋參種植基地，采回后 1—3 d 進行試驗，選取長度、直徑和重量接近的參根隨機分為 4 組，用 SPSS17.0 軟件對根重進行方差分析，表明各處理組間根重無顯著差異。

1.2 儀器和試劑

分光光度計\\(上海精密科學儀器有限公司，757CRT\\)、LI-6400/XT 便攜式光合作用測定裝置\\(LI-COR 公司，美國\\)。p-香豆酸\\(分析純\\)購自 Alfa Aesar 公司。其他試劑均為國產分析純。

1.3 西洋參種胚生長實驗

于北京市藥用植物研究所實驗田采集未種植過西洋參的土壤，土壤基礎肥力為堿解氮 64.01 mg/kg，速效磷 35.45 mg/kg，速效鉀 181.97 mg/kg，有機質 1.49%，全磷 0.0804%，全氮 0.0922%，pH6.85，采回后當天開展實驗。稱量 50 g 土壤放置于 9 cm 培養皿中，添加 15 mL 不同濃度的 p-香豆酸水溶液，添加量參照老參地土壤中 p-香豆酸的自然濃度\\(0.462—0.985 mg/g\\)設計濃度梯度，最終濃度分別為 0.0024 mg/g、0.012 mg/g、0.06 mg/g、0.3 mg/g、1.5 mg/g、7.5 mg/g，以添加相同體積蒸餾水處理作為對照。選取剛剛萌發且長勢基本一致的西洋參種子，用 5%次氯酸鈉溶液進行表面消毒后放置于土壤上層，每個培養皿中 10粒種子，每處理設 5 個重復。25 ℃恒溫培養 7 d，用直尺測量胚根和胚芽長度。

1.4 西洋參種根水培實驗

1.4.1 試驗設計

水培試驗采用 1000 mL 陶瓷罐于溫室中進行。營養液組成：硝酸鉀 2.5 mg/mL，硫酸銨 2.5 mg/mL，氯化鈣 3 mg/mL，磷酸二氫鉀 2 mg/mL，硫酸鎂 2 mg/mL。西洋參種根于蒸餾水中適應培養 10 d 后開始試驗。以前期本實驗室對西洋參根際土壤中 p-香豆酸含量測定結果為依據，濃度設計考慮水培條件下參根與目標化合物接觸更充分而適當降低，添加 p-香豆酸的終濃度分別為 0.012 mg/mL、0.06 mg/mL、0.3 mg/mL，以全營養液作為對照。每個處理設 5 個培養罐平行操作，每罐 4 株植株。溫度控制在 20—25 ℃，每天通氣約 8 h。西洋參在水培體系中 30 d 內即可完成從展葉生長到開始結果的生長周期，因此培養期設為 30 d。

1.4.2 西洋參植株的生長指標測定

試驗開始后每隔 5 d 測定各處理組每株西洋參植株的葉片展開情況\\(用展葉率表示，展葉率=展開葉片植株數/總植株數\\)、株高、冠幅\\(為植株地上部分水平直徑的平均值\\)等生長指標；并于生長 10 d\\(展葉期\\)、20 d\\(現蕾期\\)和 30 d\\(結果期\\)時從每個培養罐中隨機取 1 株，測定植株地上部分及新生須根生物量。

1.4.3 西洋參植株葉片光合特性測定

西洋參植株生長 15 d\\(展葉后期\\)時，采用 LI-6400/XT 便攜式光合作用測定裝置測定完全展開葉片的光合特性參數，采用開放式氣路，選擇上午 10:00—12:00 測定主要光合參數，環境 CO2濃度為 450—550μmol/mol，光合有效輻射為 100 μmol/\\(m2·s\\)，記錄凈光合速率\\(Pn\\)、表觀電子傳遞速率\\(ETR\\)。當晚天黑后將培養室遮光，植株暗適應 4—5 h 后，于凌晨 0:00—2:00 測定植株最大光化學效率\\(Fv/Fm\\)。每個處理重復 5 次。

1.4.4 西洋參須根中苯丙氨酸解氨酶\\(PAL\\)活力測定

于西洋參生長 10 d\\(展葉期\\)、20 d\\(現蕾期\\)和 30 d\\(結果期\\)時從每個培養罐中隨機取 1 株，參考李合生的方法分別測定新生須根 PAL 活力和蛋白質含量。具體方法：稱取 0.5 g 須根，研磨制備粗酶液，將 0.4mL 酶液、1 mL 0.02 mol/L 苯丙氨酸和 8.6 mL 0.05 mol/L 硼酸鹽緩沖液混勻，對照以蒸餾水代替酶液作為空白，反應液置于恒溫水浴 30 ℃中保溫 1 h，用分光光度計在 290 nm 處測定吸光度；蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法。每個樣品做 3 次平行操作，以每小時在 290 nm 處吸光度變化 0.01 所需酶量為 1 個單位\\(U\\)。

1.5 數據處理

利用 SPSS17.0 軟件進行方差分析和 Dunnett-t 檢驗。

2、 結果與分析

2.1 p-香豆酸對西洋參種胚生長的影響

與未添加 p-香豆酸的對照組相比，土壤中添加 0.0024 mg/g p-香豆酸處理 7 d 后西洋參胚根長度降低28.52%，0.012—0.3 mg/g p-香豆酸處理組胚根生長降低 34.55%—75.44%，達到顯著差異水平\\(P<0.05\\)，并呈現一定的劑量抑制效應，1.5 mg/g 和 7.5 mg/g p-香豆酸處理后西洋參胚根生長完全受到抑制\\(圖 1\\)。

土壤中添加 0.0024—0.06 mg/g p-香豆酸 7 d 后西洋參胚芽長度降低 1.09%—32.04%，0.3 mg/g 和 1.5mg/g p-香豆酸處理胚芽長度受抑制程度達到 59.13%和 63.39%，并與對照差異顯著\\(P<0.05\\)，7.5 mg/g 濃度下胚芽生長則完全受到抑制\\(圖 1\\)。

2.2 p-香豆酸對西洋參植株生長的影響

水培溶液中添加 p-香豆酸能夠顯著抑制西洋參植株地上部分的生長，展葉率、株高、冠幅均明顯下降\\(圖 2\\)。在西洋參生長的各個時期，隨著添加濃度增加，p-香豆酸對展葉率、冠幅及株高的抑制強度逐漸增加，并表現出一定的濃度效應。與對照組相比各處理組植株展葉時間明顯推遲，0.3 mg/mL 濃度處理組最終仍有 85%植株葉片不能完全伸展。由于處理組葉片不能完全展開或葉片面積小，植株冠幅低于對照組，0.06 mg/mL 處理組 15—20 d 時，植株冠幅低于對照 35.43%和 34.90%，且達到差異顯著水平\\(P<0.05\\)；當添加濃度提高至 0.3 mg/mL 時，在培養期內只有 1—2 株植株展葉，冠幅在 6 個采樣時間點上分別比對照低 16.61%、30.58%、47.24%、43.99%、33.79%和 28.10%，均達到顯著水平\\(P<0.05\\)。在 30 d 的培養期內，所有濃度的 p-香豆酸處理組植株株高均低于對照組，0.3 mg/mL 處理組各生長階段植株株高均顯著降低\\(P<0.05\\)，30 d 時株高比對照低 57.52%\\(P<0.05\\)。

從植株生長量上看，所有 p-香豆酸處理組的地上部鮮重均低于對照組，p-香豆酸濃度在 0.06 mg/mL以上時，處理組在結果期以前\\(10—20 d\\)植株地上部鮮重明顯降低\\(P<0.05\\)，濃度為 0.3 mg/mL 時，處理組10—30 d 植株地上部鮮重比對照分別降低 62.75%、81.28%、54.55%，且達到顯著水平\\(P<0.05，表 1\\)。

對于新生須根的生物量，在西洋參展葉期\\(10 d\\)，與對照相比 0.012 mg/mL、0.06 mg/mL p-香豆酸處理組比對照分別增加 22.67%、14.67%，0.3 mg/mL 處理組降低 20.00%，但差異均不顯著\\(P>0.05\\)；生長至現蕾期\\(20 d\\)時，3 個濃度的 p-香豆酸處理組須根生物量均低于對照，分別降低 25.33%、33.33%、41.33%，但未達到顯著水平\\(P>0.05\\)；結果期時\\(30 d\\)各濃度 p-香豆酸處理組須根的生物量均與對照接近\\(P>0.05，表1\\)。

2.3 p-香豆酸對西洋參植株光合特性的影響

與對照相比，0.012 mg/mL、0.06 mg/mL 和 0.3mg/mL p-香豆酸處理后西洋參植株葉片的 Pn 值下降41.58%、64.74%和 70.53%，p-香豆酸濃度在 0.06 mg/mL 以上時，與對照組差異達到顯著水平\\(P<0.05\\)。0.06mg/mL p-香豆酸處理后 ETR 顯著下降 5.45%\\(P<0.05\\)。p-香豆酸各濃度處理組植株 Fv/Fm 與對照無變化\\(表2\\)。

2.4 p-香豆酸對西洋參根 PAL 酶活力的影響

與對照相比，展葉期\\(10 d\\)0.012 mg/mL p-香豆酸處理后西洋參植株 PAL 酶活力略有降低，0.06 mg/mL處理組增加 69.05%，濃度增加至 0.3 mg/mL 又比對照降低 80.06%，但均未達到顯著差異水平\\(P>0.05\\)。在現蕾期\\(20 d\\)時，p-香豆酸在 0.06 mg/mL 濃度以上時對西洋參須根內 PAL 酶活力產生顯著的抑制作用，與對照組相比 0.06 mg/mL 和 0.3 mg/mL p-香豆酸處理組 PAL 酶活力降低 60.04%和 66.67%，達到顯著差異水平\\(P<0.05\\)。待西洋參生長到結果期\\(30 d\\)，所有濃度的 p-香豆酸處理組 PAL 酶活力與對照相差不大，均沒有顯著差異\\(P>0.05，圖 3\\)。

3、 討論

在以往研究化感作用的報道中，多數并未給出化感物質濃度的設計依據，采用的添加濃度往往與環境中的實際濃度并不相關。本文所用的 p-香豆酸的濃度是依據田間土壤中的測定數據，并以土壤為基質，比較客觀地反映了 p-香豆酸在田間對西洋參種胚的作用。實驗室前期測定老參地中 p-香豆酸的含量為0.462—0.985 mg/g，考慮到土壤中化感物質分布不均的情況，在種胚生長實驗中設計 p-香豆酸濃度為0.0024—7.5 mg/g。水培實驗中考慮到化感物質與根接觸更直接，采用低于田間實際的濃度，設計 0.012—0.3mg/mL 的 p-香豆酸添加量。

受土壤復雜環境的影響，來源于室內培養皿中以水和濾紙為基質的化感作用研究結果與土壤基質中的結果可能存在較大區別。我們的試驗結果表明在土壤基質中 p-香豆酸對西洋參種胚生長具有抑制活性，與前期濾紙基質中的結果一致，但作用強度有所改變。在土壤中 p-香豆酸對西洋參種胚的胚芽生長抑制作用比在濾紙片中降低，土壤添加量達到 7.5 mg/g\\(按最大田間持水量 20%計算，濃度為 37.5 mg/mL\\)時抑制率方能達到 100%，而在濾紙片中 10 mmol/L\\(1.64 mg/mL\\)p-香豆酸即可完全抑制胚芽的生長；與之相反的是，p-香豆酸在土壤中對胚根的作用比在濾紙片中增強，濃度在 0.3 mg/g\\(按最大田間持水量 20%計算，濃度為 1.5 mg/mL\\)時抑制率就高達 75.4%，而在濾紙片中濃度為 1.64 mg/mL 的 p-香豆酸也只表現出 63.4%的抑制率。p-香豆酸在土壤基質中作用強度的改變可能與土壤對化感物質的吸附、轉化、微生物的降解等作用有關，新生成物質對植物的化感活性改變?？状谷A等報道勝紅薊植株釋放的主要化感物質勝紅薊素在土壤中發生結構轉化，既可聚合為對花生和黑麥草沒有生物活性的二聚體，也可分解為甲氧基取代苯甲酸，對這兩種植物的化感活性比勝紅薊素自身更強。

對于存在連作障礙的多年生作物來說，自毒物質對成年植株是否有毒性鮮有報道，本實驗采用水培方式研究 p-香豆酸對西洋參種根生長的作用以及生理機制，其優勢在于排除田間土壤復雜環境對化感作用的影響，可以在控制條件下研究化感物質的直接作用。結果表明添加 p-香豆酸后西洋參植株展葉推遲，高濃度時\\(0.3 mg/mL\\)約 85%葉片不能完全展開，葉片生長受到嚴重抑制，導致植株光合面積大大下降。另外，p-香豆酸處理組葉片 Pn 和 ETR 均降低。因此，本文推測植株光合面積減少以及光合反應受抑制是 p-香豆酸抑制西洋參生長和生物量積累的重要原因。Blum 等報道 0.5 mmol/L\\(0.082 mg/mL\\)p-香豆酸處理黃瓜幼苗后，葉片在 1 d 內的展開面積比對照降低 71%，認為是 p-香豆酸影響黃瓜生長的原因之一；Yu 等報道水培體系中0.25 mmol/L\\(0.041 mg/mL\\)的p-香豆酸處理6 h后黃瓜幼苗葉片的Pn值比對照降低69.64%，本文中 p-香豆酸對成株西洋參生長產生化感作用的機制與以上報道一致。田間土壤中，由于可能存在生物和非生物因子影響化感物質活性，p-香豆酸對成株西洋參苗的實際作用還應通過進一步的土壤實驗進行驗證。

PAL 是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷代謝途徑的關鍵酶和限速酶，對于植物抗逆反應具有重要生理意義，由于植物用于防御的能量和物質是有限的，PAL 激活耗能可能在一定程度上影響植物的生物量積累。PAL 活力上升通常發生在植物遭遇機械損傷、病原物侵染等逆境脅迫的早期，隨脅迫時間延長，植物上調的 PAL 活力往往降低至正常水平甚至更低，同時植株生物量往往由于逆境的影響在后期有所下降。楊立報道黃瓜接種枯萎病菌\\(Plectosphaerella cucumerina\\)、大麗輪枝菌\\(Verticilliumdahlia\\)1 d 后根中 PAL 活性迅速升高，在 5 d 達到峰值，而地上、地下部的生物量在處理 7 d 時表現出降低。

本文中0.012 mg/mL p-香豆酸處理組在10—30 d西洋參須根的生物量及PAL活力與對照相比均無顯著差異\\(P>0.05\\)，說明此時沒有達到活性濃度。當濃度增加到 0.06 mg/mL 時，處理 10 d 的 PAL 活力比對照增加69.05%，表明此時西洋參根系受到脅迫因素的影響，但須根生物量并未表現出降低，推測西洋參植株的防御反應可能處在被誘導的早期階段；20 d 時 PAL 活力顯著低于對照\\(P<0.05\\)，這種現象與王海波在構建的植物應激反應動態模型中的發現一致，即 PAL 等表征應激反應的關鍵酶在植物受脅迫后并不是一直升高，而是表現出波浪狀的動態變化。當 p-香豆酸濃度提高到 0.3 mg/mL 時，10—30 d 內須根 PAL 活力和生物量均比對照降低，說明該濃度下西洋參受脅迫的程度加重，生長已受到抑制。對照及所有處理組植株培養至30 d 時，西洋參已經結果，表明生長已處于生育期的后期階段，此時植株的生長力開始減弱，須根有腐爛和脫落的現象，從而導致須根的生物量均比 10—20 d 時下降，此時對照及所有 p-香豆酸處理組 PAL 活力也均比 10—20 d 時降低。