單胺氧化酶（MAO）是一種降解生物肽的酶[1],分為兩種亞型，單胺氧化酶A（MAOA）和單胺氧化酶B（MAOB）[2].
MAO-A對底物血清素（5-HT）、去甲腎上腺素 （NE）、多巴胺（DA）和抑制劑氯吉蘭具有高度親和性[3];單胺氧化酶B是一種線粒體黃素蛋 白酶，其 作用主要為氧化脫 氨，對苯乙基胺（PEA）、苯甲胺和抑制劑司來吉蘭（deprenyl）具有高親和性[4].MAOB主要傾向于外源性胺的新陳代謝，如2-苯基乙胺，故其對酶作用物苯基乙胺以及抑制物司來吉蘭有密切關系。因此，它可以作為大腦代謝屏障限制假神經遞質 進 入 中 樞 神 經 系統[5].另外，MAOB還可以代謝大腦中的多巴胺，其抑制劑通常被用來治療帕金森病[6,7].之前研究證實，MAOB不僅存在于中樞神經系統，也存在于外周組織中，如肝臟、腎臟、腦、甲狀腺等[8,9].但MAOB主要存在于淋巴細胞和血小板中。
目前MAOB在中樞神經系統和外周器官的分布已經研究到了細胞甚至亞細胞水平，在外周神經系統的細胞及亞細胞的研究較少。在我們的研究中，通過免疫組化的方法確定大鼠外周神經系統MAOB存在，從而進一步探索MAOB與外周神經系統的關系。
1材料與方法
1.1動物
清潔級正常健康雄性SD大鼠6只，體重180-200g,購自吉林大學實驗動物中心。所有實驗過程遵循吉林大學動物實驗原則，將大鼠使用數量及承受痛苦降到最低。為大鼠提供標準的食物和自來水。
1.2初級抗體
MAOB起初是從牛的肝臟線粒體中提純而來，用于制備兔抗MAOB抗血清[10].在大鼠的腦中，這種抗血清可以通過免疫組化法將含有MAOB的細胞染色，而含有MAOA的細胞不著色。即這種抗血清特定的識別大鼠體內的MAOB.
1.3免疫組化方法-低倍鏡
根據之前的研究[11],低倍鏡下觀察的MAOB的分布其免疫組化染色通常使用親和素-生物素-過氧化物酶復合物。
取3只大鼠，腹腔注射 戊 巴 比 妥 鈉 （60 mg/kg），待大鼠麻醉后，打開胸腔，左心室插管至升主動脈，先用pH7.4 0.01M磷酸緩沖液50ml室溫下沖洗，然后用含有4%多聚甲醛、0.3%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃ 0.1M的磷酸緩沖液300ml灌注固定。灌畢后，立即取出大鼠舌體，將舌體再置入上述固定液中固定24h.將舌體于低溫培養箱中30μm冠狀切成切片，按 以下程 序培養：
①含 有0.3%聚乙二醇辛基苯基醚的磷酸緩沖液（PBS）中室溫培養1h;②含兔抗MAOB抗血清的PBS（1∶200 00）中4℃培養60h;③于生物素化的羊抗兔免疫球蛋白G（1∶1 000）中室溫培養2h;④于親和素-生物素-過氧化物酶復合物中室溫培養2h;⑤含有0.025%3,3-二氨基聯苯胺、0.6%硫酸鎳按和0.006%過氧化氫的0.05 M的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TRIS-HCl）緩沖液中室溫培養2min.待培養完成后，將標本用含有1%四氧化鋨的0.1M的磷酸緩沖液4℃固定1h,環氧樹脂脫水包埋。置于光鏡下觀察其染色。
1.4免疫組化方法-高倍鏡
同樣取3只 大 鼠，腹 腔 注 射 戊 巴 比 妥 鈉 （60mg/kg），待大鼠麻醉后，打開胸腔，左心室插管至升主動脈，先用pH 7.4 0.01M磷酸緩沖液50ml室溫下沖洗，然后用含有4%多聚甲醛、0.3%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃ 0.1M的磷酸緩沖液300ml灌注固定。灌畢后，立即取出大鼠舌體，將舌體再置入上述固定液中固定24h.固定后，將舌體用顯微用切片機50μm冠狀切成切片，并保存于0.1M的磷酸緩沖液中。
我們采用免疫酶法用親和素-生物素-過氧化物酶復合物對MAOB進行染色。染色方法如下：
①含有0.001%胰蛋白酶（Ⅲ型）的磷酸緩沖液室溫下5min;②含有5%羊血清的磷酸鹽緩沖液室溫下1h;③兔抗MAOB抗血清（1∶60 000）混合1%的正常羊血清4℃下48h;④于生物素化的羊抗兔免疫球蛋白G（1∶1 000）中室溫培養2h;⑤于親和素-生物素-過氧化物酶復合物（1∶1 000）中室溫培養2h;⑥含有0.025%3,3-二氨基聯苯胺、0.6%硫酸鎳按和0.006%過氧化氫的0.05M的三羥甲基氨基甲烷 鹽 酸 鹽 （TRIS-HCl）緩 沖 液 中 室 溫 培 養10min.待培養完成后，將標本用含有1%四氧化鋨的0.1M的磷酸緩沖液4℃固定1h,環氧樹脂脫水包埋，用超微切片機切片。切片用乙酸雙氧鈾和鉛染色溶液染色，置于透射電鏡下觀察。
2結果
2.1免疫組化-低倍鏡
低倍鏡下，在大鼠舌頭的固有層中及上皮層中發現MAOB免疫陽性區，反應陽性區域成暗黑色（圖1）。
2.2免疫組化-高倍鏡
電鏡下，我們發現有髓鞘軸突（圖2A）和無髓鞘軸突（圖3A）中存在MAOB免疫陽性區域。同時有髓鞘軸突的周邊的施萬細胞中也存在MAOB陽性區域（圖2B）。在MAOB陽性結構中，我們發現MAOB免疫陽性物質存在于軸突的線粒體外膜及其周圍。此外，并非所有的軸突線粒體外膜都呈陽性反應，部分有髓鞘軸突（圖2B）、無髓鞘軸突（圖3B）和施萬細胞（圖3C）中的線粒體外膜成免疫陰性。
3討論
根據目前的研究，我們通過使用免疫組織化學的方法研究了一定數量的有髓鞘軸突和無髓鞘軸突。在電鏡下，有髓鞘纖維軸突及無髓鞘神經纖維軸突中發現了大量的單胺氧化酶B陽性區域。陽性區域位于軸突內線粒體外膜及其周圍。這就提出一個問題，是否MAOB不僅存在于線粒體外膜上而且還存在于線粒體外膜的周圍。
MAOB免疫組化陽性區域為二氨基聯苯胺的氧化產物，通過親和素-生物素-過氧化物酶復合物法用過氧化物酶催化形成[12].在免疫組化使用過氧化物酶于電鏡觀察時，二氨基聯苯胺的氧化產物可以從原來抗原的位點上展開。此外，之前研究已經在大鼠腸嗜鉻細胞證實MAOB顯著存在于線粒體外膜上。因此，MAOB主要是位于線粒體外膜上。
同時在有髓鞘和無髓鞘軸突中我們還發現并不是所有的線粒體呈現陽性特征。有的線粒體表面呈陽性表現，有一部分線粒體卻成陰性表現。即一部分線粒體外膜上含有MAOB,另一部分線粒體外膜上沒有這種酶。這種發現可能歸因于一種或者更多的原因：
①人為造成，切片將該區域破壞；②不均勻的固定破壞了線粒體外膜上酶的活性；③部分線粒體自身就缺少這種酶[13].MAOB的基因在人和鼠中都位于X染色體上，在大鼠中MAOB編碼在核基因，在細胞質的核糖體上合成。因此，MAOB在細胞質中合成某種方式轉運到線粒體外膜上，其中任何一個環節出問題都可能導致MAOB的表達障礙。弄清楚這種表現不同的確切原因還需進一步深入研究。
單胺氧化酶B是典型的線粒體外膜上內嵌型酶，它在含多核糖體的細胞之內合成，負責兒茶酚胺類、血清素、生物胺等單胺類神經遞質氧化脫氨基作用[14].MAOB主要作用于B-苯乙胺，對選擇性的抑制劑如丙炔苯丙胺敏感。在之前的研究中，已通過組織化學的方法證實了MAO存在于大鼠外周神經，即坐骨神經中，并證實了軸突外的MAO為生物胺的屏障系統。
MAOB可代謝胺類神經遞質，神經遞質功能就是傳導神經沖動，神經遞質正常的的合成與降解對軸突之間神經沖動的傳導有著重要的作用。本研究發現MAOB在大鼠外周神經軸突大量表達，為進一步探討MAOB與軸突運輸及神經傳導的關系提供了形態學依據。
