社會交往是個體在社會群體里必不可少的溝通方式，有助于個體成長和后代繁衍。即使簡單的社會交往行為也需要神經系統精確的分析、整合外界信息并調節運動系統使行為正常進行。許多精神-神經性疾病 \\( 如孤獨癥、抑郁癥等\\) 的患者都表現出不同程度的社會交往障礙。嚙齒類動物的社會交往主要依靠嗅覺系統來進行信息交流，其嗅覺系統分為主嗅覺系統和犁鼻系統。社會交往行為中，主嗅覺系統主要探測空氣中傳播的揮發性化學物質，而梨鼻系統探測和處理動物釋放的信息素引起動物產生相應的行為反應。采用化學方法或破壞嗅上皮或者手術切除犁鼻器官導致嗅覺系統功能不完整時，動物的異性別社會交往行為表現異常。同性別社會交往在社會交往行為中占有重要比例，但是目前關于嚙齒類動物的同性別社會交往行為研究較少。究竟有哪些腦區可能參與了此類交往活動鮮有報道。細胞外信號調節激酶 \\( extracellular signal-reg-ulated kinase 1 /2，EＲK1 /2\\) 作為調節轉錄因子活性的重要信號分子，通過磷酸化快速將細胞外信號轉至細胞內調節基因轉錄。pEＲK1/2 可被作為神經元迅速激活的一個可靠的標志物研究與動物某行為有關的腦區。本實驗用三箱室社會交往箱觀察雄性大鼠同性別社會交往行為，同時運用免疫組織化學觀察 pEＲK1/2 在 大 鼠 腦 內 表 達 的 變 化 以 探 討pEＲK1 /2 在大鼠同性別社會交往中的作用。

材料和方法

1 材料

健康清潔級成年雄性 SD 大鼠，體重220 ～260 g，由中南大學實驗動物學部提供。實驗前所有大鼠均飼養在動物室適應環境一周后開始實驗。社會交往箱如圖 \\( Fig． 1\\) 所示。將雄性大鼠分組進行正常情況下同性別社會交往實驗和嗅覺剝奪后同性別社會交往實驗。兩組實驗分別設置對照組: 社會交往箱中兩側無交往對象鼠時在箱中活動情況 \\( 非社會交往組\\) 和用生理鹽水滴鼻后進行社會交往實驗。

2 方法

2． 1 同性別社會交往行為檢測方法 在社會交往行為檢測前，待測雄鼠于每天下午 2∶ 00 置于社會交往箱中間的大有機玻璃箱內 8 min 適應環境，每日 1 次，連續 4 d。社會交往行為檢測時，先將正常雄性大鼠隨機的放在社會交往箱的一側小箱子里，另一端的小箱子保持空白，再將待測鼠放在中間大箱子的正中間的區域，攝像機記錄 10 min 內待測鼠在社會交往箱社會交往側 \\( 含有正常大鼠一側\\) 和無生命體側 \\( 空白箱一側\\) 停留的時間、接觸兩端金屬網的次數。當雄鼠四足都跨出社會交往箱底部的中間區域開始記錄雄鼠在社會交往箱左、右兩個區域停留的時間，當雄鼠任意一足跨入社會交往箱底部正中間區域時停止記時。每只雄鼠檢測結束后，將其放回原籠，清掃糞便，并用70% 酒精去除社會交往箱內的殘余氣味。
2． 2 硫酸鋅滴鼻嗅覺剝奪方法 本 實驗采用10% 硫酸鋅破壞雄鼠的嗅上皮，研究主嗅覺系統在雄鼠同性別社會交往行為中的作用。用 10% 水合氯醛將動物麻醉后，仰臥位置于手術臺上，兩側鼻孔內滴注 10% 硫酸鋅溶液 \\( 天津市博迪化工股份有限公司\\) 直至有液體從鼻孔內流出為止，對照組雄鼠兩側鼻孔內滴入生理鹽水。待動物完全蘇醒后放回動物室。動物嗅覺剝奪后第 1 d 進行嗅覺檢測，確定嗅覺功能喪失后進行社會交往實驗。
2． 3 免疫組織化學染色 行為實驗結束后立即10% 水合氯醛麻醉，用生理鹽水灌注后再用 4℃ 的4% 多聚甲醛固定液固定，取腦于 4°冰箱后固定過夜，15%、30% 蔗糖脫水后做連續冠狀面冰凍切片，切片厚度 30 um。切片用 3% 過氧化氫溶液處理 16 min 以阻斷內源性過氧化物酶的影響，0． 1%Triton X-100 的 5% BSA 室 溫 封 閉 2 h， 一 抗pEＲK1 /2 \\( 兔抗，1 ∶ 1000，Cell Signaling\\) 室溫孵育 2 h 后，4℃冰箱中孵育過夜。第 2 天，復溫 30min 后，加生物素化羊抗兔 IgG \\( 1 ∶ 200，Vector\\) ，室溫孵育 2 h 后，過氧化物酶標記的 ABC 復合物\\( A 液和 B 液/1∶ 200，提前 30 min 配制\\) 室溫孵育2 h 后，DAB 液顯色，第 2 天開始每步驟之前用 0．01 mol / L PBS 振蕩漂洗 8 min × 3 次。
統計學處理: 采用 Nikon H600L 顯微鏡下觀察pEＲK1 /2 免疫陽性細胞表達的腦區。采集 10 倍圖像，HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖像分析系統\\( 同濟醫科大學千屏影像工程公司\\) 統計每平方毫米免疫陽性細胞數。所得數據均以 Mean ± SD 表示，采用 SPSS 13． 0 軟件和 Graphad prism5． 0 進行統計分析，Levene 檢驗進行方差齊性檢驗 \\( 方差齊性檢驗水準為 0． 10\\) ，Two-Way ANOVA 進行兩樣本均數的比較，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析 \\( One-Way ANOVA\\) ，多個樣本均數間的多重比較采用 post hoc Dunnett 檢驗。P 值小于 0．05 認為差異具有統計學意義。

結 果

1 正常雄性大鼠同性別社會交往行為

當社會交往箱左右兩端都沒有放入交往對象鼠時，正常雄鼠在社會交往箱兩側停留的時間差異無統計學意義 \\( t = 0． 4136，P ＞ 0． 05\\) 。當一側有交往對象鼠時，大鼠在社會交往側停留的時間明顯多于在無生命體側停留的時間 \\( t = 3． 639，P ＜ 0．001，Fig． 2\\) 。
2 正常雄鼠與同性別大鼠社會交往后腦內 pEＲK1 /2表達

正常雄鼠與同性別大鼠社會交往后，多個腦區內存在 pEＲK1/2 的陽性表達: 與空白對照組和非社會交往組雄鼠相比，社會交往組雄鼠在與主嗅覺系統相關的腦區 \\( 如主嗅球 dGrA、vGrA，梨狀皮質 Pir、內嗅皮質 Ent\\) 以及室旁核 PVN、眶額皮質OFC、前扣帶皮質 ACC、杏仁中央核 CeA 與杏仁內側核 MeA\\) 內 pEＲK1/2 陽性細胞表達數量明顯增加 \\( P ＜0． 01\\) ，在副嗅球僧帽細胞層 MIA 和顆粒層 GrA 內 pEＲK1/2 陽性細胞表達數量差異無顯著性 \\( P ＞0． 05\\) 。

3 ZnSO4 嗅覺剝奪后社會交往行為及腦內 pEＲK1 /2表達變化

鼻腔滴生理鹽水的對照組大鼠在社會交往測停留的時間明顯多于無生命體側 \\( P ＜0． 05\\) ，而嗅覺被剝奪后大鼠在社會交往箱中社會交往側和無生命體側停留的時間差異無統計學意義 \\( P ＞ 0． 05，Fig． 4\\) 。雄鼠腦內 pEＲK1 /2 在主嗅覺系統相關腦區 \\( 主嗅球、內嗅皮質、梨狀皮質\\) 表達明顯下降，在杏仁中央表達明顯增加 \\( Fig． 5\\) 。
談論

Crawley 等人進行小鼠的社會交往實驗時發現小鼠存在明顯的社會交往傾向，但是未探究參與社會交往行為的神經調節機制。本實驗采用三箱室社會交往箱研究大鼠同性別社會交往行為，以pEＲK 作為標志物研究參與社會交往相關腦區。
同樣地，我們發現當社會交往箱兩側都空箱，大鼠放于社會交往箱中時，大鼠未表現出左右兩側的位置選擇偏好。當一側小箱放有交往對象鼠時，大鼠在社會交往箱中表現出明顯的社會交往偏好。10min 社會交往行為后大鼠腦內與主嗅覺系統相關的腦區 \\( 如主嗅球、梨狀皮質、內嗅皮質\\) 、室旁核、杏仁中央與內側核 pEＲK1/2 表達明顯上調，而副嗅球 pEＲK1/2 的表達在社會交往組與非社會交往組差異無顯著性。Dudley 等人發現主嗅球、副嗅球、杏仁核及前扣帶皮質在嚙齒類的異性別社會交往中被激活。這提示梨鼻系統在異性別社會交往中的發揮特異性作用，而主嗅覺系統參與在同性別社會交往行為作用。硫酸鋅可以破壞雄鼠的嗅粘膜，引起動物主嗅覺系統功能暫時性喪失。
但是不影響動物梨鼻系統功能和情緒反應。我們用硫酸鋅滴鼻破壞大鼠的主嗅覺系統，嗅覺剝奪后雄鼠在社會交往箱中社會交往偏好現象消失，表明主嗅覺系統被破壞將影響大鼠的同性別社會交往行為，同時大鼠與主嗅覺系統相關的腦區 pEＲK1/2表達下降。
有多個文獻報道 EＲK1/2 參與動物社會交往行為: SL327 \\( MEK 抑制劑抑制 EＲK 磷酸化\\) 處理的小鼠表現為社會交往行為減少，EＲK2 基因敲除后小鼠也表現為社會交往行為減少，轉基因雌性小鼠前額葉皮質過表達 EＲK2，社會交往行為增加。表明 pEＲK1/2 參與了小鼠社會交往行為，本實驗同性別社會交往行為后主嗅覺相關腦區pEＲK1 /2 表達上調亦提示 pEＲK1 /2 可能參與大鼠同性別社會交往行為。MAPK 信號通路在突觸形成和個體學習記憶中具有重要作用。有研究表明嗅覺記憶形成期間，嗅球 MEK1 表達上調。主嗅覺系統信號的轉導有賴于 III 型 cAMP 酶和主要控制Ca 離子進出的環核苷酸門控通道 \\( CNP\\)。在大鼠社會交往時，信號通過主嗅覺系統細胞內cAMP 轉導和 CNP 激活， 參與調節社會偏好行為。海馬在記憶形成中，cAMP 和 CNP 信號轉導激活下游 EＲK 信號通路。主嗅覺系統細胞內cAMP 轉導和 CNP 可能激活下游 MAPK 信號通路對個體識別和記憶并調節大鼠交往行為。然而主嗅覺系統 pEＲK1/2 在大鼠同性別社會交往中的作用需要進一步的實驗進行證實。
本實驗用 pEＲK1/2 為標志物檢測大鼠同性別社會交往行為后各腦區激活狀況，發現與主嗅覺系統相關的腦區被激活。應用 ZnSO4 破壞大鼠主嗅覺系統導致大鼠同性別社會交往行為降低，主嗅覺系統相關腦區激活程度下降，提示主嗅覺系統相關腦區與大鼠同性別社會交往行為存在密切聯系。

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