摘要：核酸適配體是一種經由體外指數級富集系統進化技術篩選得到的隨機寡核苷酸片段，該寡核苷酸片段能特異性結合靶物質。核酸適配體與固相萃取技術相結合，可以高選擇性地應用于復雜樣品中痕量組分的萃取、分離、富集和純化，由此引起了廣泛關注。該文綜述了基于核酸適配體的固相萃取研究進展，著重評述了核酸適配體固相萃取柱的制備、固相萃取過程、面臨的問題和應用前景。
關鍵詞：固相萃??；樣品前處理；親和吸附；核酸適配體；復雜樣品；綜述。
Abstract:Aptamers are short single-stranded oligonucleotides within randomly synthesizednucleic acid libraries by a systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Because ofspecific identification for target molecule,solid phase extraction technique based on aptamersexhibits great potential for extraction,separation,purification and enrichment of trace-targetanalytes from complex samples,and it attracts more and more attention. This article brings acomprehensive survey of recent developments of solid phase extraction techniques based onaptamers,including the preparation of aptamer-based sorbents,the solid phase extraction pro-cedure and the applications of aptamer-based solid phase extraction. Limits and prospects foraptamer-based solid phase extraction are also discussed.
Key words:solid phase extraction （SPE）；sample pretreatment;affinity adsorption;aptamer;complex sample;review.
固相萃?。╯olid phase extraction,SPE）[1]因其易于實現自動化和靈活性高的特點，被廣泛應用于分離和富集過程，已被認為是分析測試前對樣品進行前處理的標準方法之一。SPE 利用固體吸附劑吸附液體樣品中的目標分析物，使其與樣品基質和干擾物分離，再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標分析物的目的。使用 SPE 吸附富集可大大增強分析物的檢出能力，提高待測組分的回收率。SPE 方法中固體吸附劑的選擇是決定萃取效率、富集倍數和吸附材料使用壽命的重要因素。然而傳統的 SPE 吸附材料（如 C8、C18等）具有萃取選擇性低的缺點，難以高效地用于復雜樣品中痕量目標分析物的萃取和富集。
為提高 SPE 材料的選擇性，一系列基于“分子識別”的功能化吸附劑被研發出來，主要包括基于抗 體[2]、分 子 印 跡 技 術[3]以 及 核 酸 適 配 體（aptamer）[4]的吸附材料。其中，基于抗體的吸附材料特異性強，但抗體的獲得費時且昂貴[2].分子印跡聚合物制備方便，然而模板的洗脫費時且難以達到洗脫完全的效果[3].
近年來，已有不少研究以核酸適配體作為親和配基應用于 SPE,并獲得了很好的效果。核酸適配體是一種經由體外指數級富集系統進化（systema-tic evolution of ligands by exponential enrich-ment,SELEX）[5]技術篩選得到的隨機寡核苷酸片段，可以是 DNA 或 RNA,能特異性結合靶物質。核酸適配體可通過分子內的相互作用，如氫鍵、堿基互補配對等，形成多種三維空間結構，包括發夾、凸環、假結和 G 四聯體結構等。依據這種三維空間結構，核酸適配體可以廣泛地與目標結合，從金屬離子[6]到小分子[7]、大分子蛋白質[8],乃至整個細胞[9].核酸適配體又被稱為“化學抗體”,但與抗體不同的是，核酸適配體可以大批量體外合成，這使核酸適配體在生物化學分析領域有更廣泛的應用空間。
由于基于核酸適配體功能化材料的 SPE 方法具有高選擇性和高特異性的特點，近年來受到廣泛關注。本文著重綜述基于核酸適配體的 SPE 技術研究進展，對基于核酸適配體的 SPE 材料的制備、SPE 過程、應用、面臨的問題和前景進行綜述。
1 基于核酸適配體的固相萃取吸附劑。
基于核酸適配體的 SPE 技術的核心是制備基于核酸適配體的吸附材料，這其中涉及固相載體的選擇和活化、適配體的修飾及其在載體表面的固定。
1.1 載體的選擇。
選擇合適的載體材料用于核酸適配體的固定對于基于核酸適配體的吸附劑的制備是很重要的環節。此載體材料需要具備以下屬性：（1）化學/ 生物惰性，以便在 SPE 過程中不與分析物或基質產生化學反應；（2）能夠在一定程度上耐受酸堿及有機溶劑，這樣可以在選擇上樣和洗脫溶液時不受載體的局限；（3）良好的機械穩定性，以及均一的粒徑和形態；（4）由于需要進一步在此材料表面固定核酸適配體，所以此載體材料的表面最好容易活化；（5）親水的表面，這樣可以最大限度地減小由載體造成的非特異性吸附。目前常用的載體材料有硅[10]、瓊脂糖[11]、凝膠[12]、聚苯乙烯[13]、有機或金屬聚合物骨架[4]等。載體的種類會影響 SPE 的表現，Madru等[14]報道了一種基于核酸適配體的 SPE 柱，是以溴化氰活化的凝膠作為載體，并對比了多種載體，包括鏈霉親和素活化的瓊脂糖、巰基活化的凝膠以及戊二醛活化的凝膠，結果顯示以溴化氰活化的凝膠為載體的吸附劑對目標分析物的保留、選擇性、吸附容量以及重復性等參數最佳。
1.2 間隔體的選擇。
間隔體（spacer）是指核酸適配體與載體之間的間隔連接體，它會在載體材料的表面與適配體之間產生一個化學間隔，以便二者的間隔臂（arm）相連接。間隔體能夠影響核酸適配體在載體材料表面的固定密度、載體表面的性質，進而對 SPE 柱的吸附容量和吸附選擇性產生影響[15].隨著間隔體長度的增加，核酸適配體在載體表面的密度下降，與此同時核酸適配體在空間上更易接近目標分析物，會導致 SPE 柱對目標分析物的捕獲效率增加，但吸附容量會有所下降[15,16].Wang 等[17]使用具有防污功能的聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯作為間隔體制備了基于核酸適配體的 SPE 材料，與未使用該間隔體的材料相比，大大提高了捕獲血清中 Ramos 細胞的選擇性和特異性。常用的間隔體還包括 3-氨丙基三乙氧基硅烷[18,19]、烷基鏈[14]、聚乙二醇[13,16]等。
1.3 適配體在載體表面的固定。
固定核酸適配體的方法包括非共價鍵和共價鍵兩種形式。非共價鍵的方法常采用經典的生物素-鏈霉親和素或生物素-親和素橋連的方法。該方法很容易構建，并且可買到商業化的相關材料，比如鏈霉親和素或親和素包被的磁珠、多孔硅膠以及聚苯乙烯球等。這種非共價鍵的方法有很高的效率，并且可以維持材料表面的生物相容性，最大限度地維持核酸適配體的結合能力，已被廣泛用于包括 SPE在內的分離材料和生物芯片的制備中。該方法操作簡單，通常將生物素修飾的核酸適配體與鏈霉親和素[11,14]或親和素[20,21]包被的載體材料混合。但這種方法也有一些缺點，比如重復利用率低、材料的壽命短，尤其當使用有機物修飾的載體材料或者使用高比例有機溶劑作洗脫溶液時，有機材料或有機溶劑會影響生物素與鏈霉親和素之間的作用力[11].有研究[18]曾采用生物素-鏈霉親和素連接對比共價連接的方式固定核酸適配體，制備了兩種基于核酸適配體的固相微萃?。╯olid phase microextrac-tion,SPME）纖維，并對比二者在萃取腺苷時的表現，結果顯示以非共價方式固定核酸適配體制備的SPME 纖維吸附性能不及共價方式制備的 SPME纖維。
關鍵詞：固相萃??；樣品前處理；親和吸附；核酸適配體；復雜樣品；綜述。
Abstract:Aptamers are short single-stranded oligonucleotides within randomly synthesizednucleic acid libraries by a systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Because ofspecific identification for target molecule,solid phase extraction technique based on aptamersexhibits great potential for extraction,separation,purification and enrichment of trace-targetanalytes from complex samples,and it attracts more and more attention. This article brings acomprehensive survey of recent developments of solid phase extraction techniques based onaptamers,including the preparation of aptamer-based sorbents,the solid phase extraction pro-cedure and the applications of aptamer-based solid phase extraction. Limits and prospects foraptamer-based solid phase extraction are also discussed.
Key words:solid phase extraction （SPE）；sample pretreatment;affinity adsorption;aptamer;complex sample;review.
固相萃?。╯olid phase extraction,SPE）[1]因其易于實現自動化和靈活性高的特點，被廣泛應用于分離和富集過程，已被認為是分析測試前對樣品進行前處理的標準方法之一。SPE 利用固體吸附劑吸附液體樣品中的目標分析物，使其與樣品基質和干擾物分離，再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標分析物的目的。使用 SPE 吸附富集可大大增強分析物的檢出能力，提高待測組分的回收率。SPE 方法中固體吸附劑的選擇是決定萃取效率、富集倍數和吸附材料使用壽命的重要因素。然而傳統的 SPE 吸附材料（如 C8、C18等）具有萃取選擇性低的缺點，難以高效地用于復雜樣品中痕量目標分析物的萃取和富集。
為提高 SPE 材料的選擇性，一系列基于“分子識別”的功能化吸附劑被研發出來，主要包括基于抗 體[2]、分 子 印 跡 技 術[3]以 及 核 酸 適 配 體（aptamer）[4]的吸附材料。其中，基于抗體的吸附材料特異性強，但抗體的獲得費時且昂貴[2].分子印跡聚合物制備方便，然而模板的洗脫費時且難以達到洗脫完全的效果[3].
近年來，已有不少研究以核酸適配體作為親和配基應用于 SPE,并獲得了很好的效果。核酸適配體是一種經由體外指數級富集系統進化（systema-tic evolution of ligands by exponential enrich-ment,SELEX）[5]技術篩選得到的隨機寡核苷酸片段，可以是 DNA 或 RNA,能特異性結合靶物質。核酸適配體可通過分子內的相互作用，如氫鍵、堿基互補配對等，形成多種三維空間結構，包括發夾、凸環、假結和 G 四聯體結構等。依據這種三維空間結構，核酸適配體可以廣泛地與目標結合，從金屬離子[6]到小分子[7]、大分子蛋白質[8],乃至整個細胞[9].核酸適配體又被稱為“化學抗體”,但與抗體不同的是，核酸適配體可以大批量體外合成，這使核酸適配體在生物化學分析領域有更廣泛的應用空間。
由于基于核酸適配體功能化材料的 SPE 方法具有高選擇性和高特異性的特點，近年來受到廣泛關注。本文著重綜述基于核酸適配體的 SPE 技術研究進展，對基于核酸適配體的 SPE 材料的制備、SPE 過程、應用、面臨的問題和前景進行綜述。
1 基于核酸適配體的固相萃取吸附劑。
基于核酸適配體的 SPE 技術的核心是制備基于核酸適配體的吸附材料，這其中涉及固相載體的選擇和活化、適配體的修飾及其在載體表面的固定。
1.1 載體的選擇。
選擇合適的載體材料用于核酸適配體的固定對于基于核酸適配體的吸附劑的制備是很重要的環節。此載體材料需要具備以下屬性：（1）化學/ 生物惰性，以便在 SPE 過程中不與分析物或基質產生化學反應；（2）能夠在一定程度上耐受酸堿及有機溶劑，這樣可以在選擇上樣和洗脫溶液時不受載體的局限；（3）良好的機械穩定性，以及均一的粒徑和形態；（4）由于需要進一步在此材料表面固定核酸適配體，所以此載體材料的表面最好容易活化；（5）親水的表面，這樣可以最大限度地減小由載體造成的非特異性吸附。目前常用的載體材料有硅[10]、瓊脂糖[11]、凝膠[12]、聚苯乙烯[13]、有機或金屬聚合物骨架[4]等。載體的種類會影響 SPE 的表現，Madru等[14]報道了一種基于核酸適配體的 SPE 柱，是以溴化氰活化的凝膠作為載體，并對比了多種載體，包括鏈霉親和素活化的瓊脂糖、巰基活化的凝膠以及戊二醛活化的凝膠，結果顯示以溴化氰活化的凝膠為載體的吸附劑對目標分析物的保留、選擇性、吸附容量以及重復性等參數最佳。
1.2 間隔體的選擇。
間隔體（spacer）是指核酸適配體與載體之間的間隔連接體，它會在載體材料的表面與適配體之間產生一個化學間隔，以便二者的間隔臂（arm）相連接。間隔體能夠影響核酸適配體在載體材料表面的固定密度、載體表面的性質，進而對 SPE 柱的吸附容量和吸附選擇性產生影響[15].隨著間隔體長度的增加，核酸適配體在載體表面的密度下降，與此同時核酸適配體在空間上更易接近目標分析物，會導致 SPE 柱對目標分析物的捕獲效率增加，但吸附容量會有所下降[15,16].Wang 等[17]使用具有防污功能的聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯作為間隔體制備了基于核酸適配體的 SPE 材料，與未使用該間隔體的材料相比，大大提高了捕獲血清中 Ramos 細胞的選擇性和特異性。常用的間隔體還包括 3-氨丙基三乙氧基硅烷[18,19]、烷基鏈[14]、聚乙二醇[13,16]等。
1.3 適配體在載體表面的固定。
固定核酸適配體的方法包括非共價鍵和共價鍵兩種形式。非共價鍵的方法常采用經典的生物素-鏈霉親和素或生物素-親和素橋連的方法。該方法很容易構建，并且可買到商業化的相關材料，比如鏈霉親和素或親和素包被的磁珠、多孔硅膠以及聚苯乙烯球等。這種非共價鍵的方法有很高的效率，并且可以維持材料表面的生物相容性，最大限度地維持核酸適配體的結合能力，已被廣泛用于包括 SPE在內的分離材料和生物芯片的制備中。該方法操作簡單，通常將生物素修飾的核酸適配體與鏈霉親和素[11,14]或親和素[20,21]包被的載體材料混合。但這種方法也有一些缺點，比如重復利用率低、材料的壽命短，尤其當使用有機物修飾的載體材料或者使用高比例有機溶劑作洗脫溶液時，有機材料或有機溶劑會影響生物素與鏈霉親和素之間的作用力[11].有研究[18]曾采用生物素-鏈霉親和素連接對比共價連接的方式固定核酸適配體，制備了兩種基于核酸適配體的固相微萃?。╯olid phase microextrac-tion,SPME）纖維，并對比二者在萃取腺苷時的表現，結果顯示以非共價方式固定核酸適配體制備的SPME 纖維吸附性能不及共價方式制備的 SPME纖維。
