代謝組學研究生物體內源代謝物的種類、數量及其在內外因素作用下的變化規律，是系統生物學的重要組成部分，也是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后迅速發展起來的新興學科。代謝組學定義有20世紀90年代末Nicholson提出的"metabonomics"[1]和 21 世紀初 Fiehn 提出的"metabolomics"[2]兩種，兩者在拼寫及側重點稍有不同，但本質上都是指從整體上研究生物體的代謝產物。目前，對于代謝組學的定義為"對某一生物、組織或細胞中所有低分子量（通常指分子量<1000）代謝產物進行定性和定量分析的一門科學。代謝產物作為生物體在內外因素作用下基因轉錄和蛋白表達的最終結果，是生物體表型的物質基礎。同時代謝產物又能影響或調節基因的轉錄和蛋白的表達和活性。代謝組與基因組、轉錄組、蛋白組相比更接近生物體的表型，基因組和蛋白組的微小變化可以在代謝組層面得以體現和放大[3].因此，代謝組學研究越來越受到廣泛關注，代謝組學手段在解析生物系統及基因功能等方面也發揮著越來越重要的作用。

在整個代謝組學的研究中，植物代謝組的研究占有重要的地位。作為一類固著性生物，植物可以產生種類繁多的代謝產物，總數在20萬~100萬種之間[4].植物代謝物大體可分為初生代謝物和次生代謝物兩大類。初生代謝物為維持植物生命活動和生長發育所必須[5],次生代謝物則更多的參與植物抗病、抗逆等環境應答[6,7].植物代謝物種類繁多，結構各異、含量差異很大，這一方面使植物成為了研究代謝物生物合成及其調控的理想材料，同時植物代謝物的復雜性也對植物代謝組學研究提出了嚴峻的挑戰[8,9].近年來，隨著代謝組學分析技術的發展，特別是基于質譜及核磁共振的代謝譜分析的發展，代謝組學研究的內容不斷擴展[10,11].另外，通過代謝組學與其他組學技術（如轉錄組學、基因組學）的整合[12],植物代謝組學在功能基因鑒定、代謝途徑解析及自然變異的遺傳分析等方面都取得了較大的進展[13~17].本文綜述植物代謝組學技術及其研究現狀和前景。

1 植物代謝組學技術

與其他組學技術只需分析相同或相似的特定類型對象不同，代謝組學特別是植物代謝組學所要分析的對象種類繁多、理化性質各異、濃度范圍分布極廣，依靠單一的分析手段難以對全部植物代謝物進行無偏檢測。目前，基于色譜（氣相、液相、毛細管電泳）、質譜（mass spectrometry,MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）、傅里葉變換-紅外光譜（Fourier transform-infrared spectrometer,FT-IR）等分析平臺在植物代謝組學研究中都得到了廣泛應用，其中研究最深入、應用最廣的是核磁共振和色譜-質譜聯用兩大技術平臺。

1.1 基于核磁共振平臺的代謝組學技術

核磁共振技術是代謝組學研究中應用最早、最為常見的技術之一[18,19].核磁共振是一種基于具有自旋性質的原子核在核外磁場作用下吸收射頻輻射而產生能級躍遷的譜學技術，常用的有氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）、磷譜（31P-NMR），其中1H-NMR應用最為廣泛。核磁共振技術樣品用量小、幾乎不需要進行樣品前處理，而且能夠提供代謝物準確的結構信息。核磁共振技術的不足在于其檢測靈敏度低、分辨率不高，難以檢測豐度較低的代謝物。近年來，隨著950 MHz高場強核磁共振及超低溫探頭技術（cryoprobe technology）等的發展，檢測分辨率和靈敏度得到了較大的提高[20],加之其無損傷性、分析速度快、代謝物檢測的無偏性等特點，核磁共振技術在植物代謝組學研究中應用將更加廣泛。

1.2 基于色譜-質譜平臺的代謝組學技術

基于氣相色譜-質譜（GC-MS）技術的代謝組學平臺主要用于分析熱穩定、易揮發、能氣化的小分子代謝物，分離效率高，具有較高的分辨率和靈敏度[21,22].另外，氣相色譜-質譜檢測結果可通過與標準譜圖庫比對獲得代謝物結構信息，易于對代謝物進行定性。利用多維色譜技術發展的全二維色譜質譜聯用技術，如全二維氣相色譜-飛行時間質譜（GC×GC-TOF/MS）能夠進一步提高色譜分離效果和峰容量，同時通過提高靈敏度和聚焦效果增加代謝物的檢出量，展示了對于復雜生物學樣品分析的優越性能。氣相色譜-質譜發展較為成熟，已經成為植物代謝組研究中廣泛應用的分析方法，是目前復雜樣品中代謝物分析的主要定性和定量手段之一[23].

基于液相色譜-質譜（LC-MS）的代謝物檢測方法檢測限寬、靈敏度高，對待測組分的揮發性和熱穩定性沒有要求，通過選擇不同類型色譜柱可以實現從極性到非極性的各種代謝物特別是各種次生代謝物的檢測，一般也不需要衍生化的復雜的前處理，因此在植物代謝物檢測技術的發展中越來越受到重視[24].傳統的液相色譜-質譜方法有靶向代謝組學（targeted metabolomics）[25,26]和非靶向（non-targeted/untargetedmetabolomics）[27,28]兩大類。靶向代謝組學方法只能對少數（一般少于100種）已知代謝物進行定性和定量檢測，但其具有靈敏度高、定量準確的特點。與之相反，非靶向代謝組學方法能夠同時檢測數百乃至數千種代謝物（包括已知和未知代謝物），但其靈敏度較之前者減低1~2個數量級，定量準確性也相對較差[29].針對上述兩種方法的優缺點，近年來相繼發展出能夠同時定性、定量數百種已知代謝物和定量近千種已知及未知代謝物的廣泛靶向代謝組學分析方法（widely-targeted metabolomics）。

筆者開發的一種新的廣泛靶向代謝組學分析方法，能夠在30 min內定量超過800種已知和未知代謝物[28].該方法與靶向方法具有相同的靈敏度和定量準確性，同時結合了非靶向方法代謝物種類覆蓋廣泛、檢測數量大的優點，在一定程度上代表了代謝組學檢測手段的發展趨勢，特別適合對大量試樣的高通量、廣覆蓋的代謝組學分析，具有非常廣泛的應用前景。在液相色譜技術方面，超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography,UPLC）及超高壓系統（壓力大于105 kPa）等新型液相色譜技術的應用能顯著改善色譜分離度，與質譜聯用時基質干擾減小，在提高檢測靈敏度的同時大大縮短了分析周期。因此，超高效液相色譜-質譜替代傳統液相色譜-質譜特別適用于微量復雜混合物的分離和高通量代謝組學分析，在植物代謝組學研究中得到了快速而廣泛的應用。

毛細管電泳技術是基于帶電分子在電場中的泳動速度差異而實現代謝物分離分析的技術。毛細管電泳技術與其他色譜技術互補，特別適于利用廣泛靶向代謝組學手段對離子型代謝物（如核苷酸、有機酸、氨基酸、磷酸化的寡糖等植物初生代謝物）的分離和分析[30,31].毛細管電泳質譜（CE-MS）將毛細管電泳快速、高效、分辨率高、重復性好等特點和質譜分析靈敏度高、速度快等優點相結合，在強極性代謝物，特別是帶電代謝物的分離分析中具有廣泛的應用前景[32,33].

1.3 代謝物的注釋

除了代謝組學分析平臺方面的發展以外，代謝物的結構鑒定或注釋也是目前代謝組學分析中的一個重點和難點問題。到目前為止，代謝組學主要集中在對已知代謝物的研究方面。值得注意的是，隨著代謝組學技術的發展，特別是非靶向和廣泛靶向技術的發展，代謝組學分析過程中獲得了大量"未知代謝物"的定量信息。這些"未知代謝物"能夠在代謝組學分析中被重復、穩定的定量檢測，但是其化學結構未知。雖然它們可能是生理、病理及逆境響應中的重要生物標志物，或是直接在上述過程中發揮作用，但是由于缺乏相應的結構信息，很難對這些未知代謝物進行深入研究，進一步的應用也受到很大限制。由于代謝物結構的解析需要對代謝物進行分離、純化，并獲得其核磁共振、光譜等綜合特征，難以達到組學對分析通量的要求，目前代謝組學中未知代謝物的解析工作主要集中在其結構注釋方面。

利用飛行時間質譜、傅里葉變換質譜及軌道阱質（orbitrap）譜等可以提供代謝物的精確質量，多重質譜（MSn）能夠提供代謝物完整的碎片離子信息。通過對這些信息的分析和處理，能夠得到代謝物的相對分子質量、元素組成及官能團等結構信息，并進而利用生物信息學手段進行代謝物結構注釋?；诖?，近年建立了一系列公共代謝組學數據庫，如MassBank[34]、KNApSAcK Core Database[35]、Plant MetabolomeDatabase（PMD）[36]、Metlin[37]、Golm Metabolome Database（GMD）[38]、Platform for RIKE Metabolomics（PRIMe）[39]、MeltDB[40]及 Madison Metabolomics Consortium Database（MMCD）[41]等。部分公司也提供商業化的代謝組學數據庫，如Agilent Fiehn GC-MS Metabolomics Library、Agilent MetlinPersonal Metabolite Database、Wiley Registry/NIST Mass Spectral Library等。同時，也開發出一些用于解析質譜和核磁共振數據及通過整合代謝途徑信息進行代謝物注釋的工具。

近年來還發展了一種利用系統生物學手段進行未知代謝物結構鑒定及注釋的功能代謝組方法。該方法利用正向遺傳學手段獲得未知代謝物與已知功能基因的關聯信息，結合代謝物之間的相關性及代謝途徑/網絡分析，對未知代謝物進行結構注釋，或進一步通過與標準品的比對進行結構確證[42].筆者將上述方法與質譜獲得的結構信息整合，注釋水稻中包括類黃酮、維生素、萜類等超過160個未知代謝物，并鑒定了其中部分代謝物的結構[13],取得了良好的效果。

2 植物代謝組學研究進展

植物代謝物是植物生物體生理狀態在代謝水平的體現。任何生長發育及環境因子等內、外因素對植物體的擾動都會引起植物代謝物濃度或代謝流的變化，且大多數情況下這種變化不是表現為一個或少數幾個代謝物的變化，而是多個代謝物甚至是多個代謝途徑的改變。由于代謝組學從整體上檢測代謝產物的變化，因此被越來越廣泛地應用于植物生物學及相關領域的研究中。限于篇幅，本文僅對代謝組學在植物生物學基礎研究中的進展進行簡要介紹（圖1）。

2.1 用于植物代謝物積累模式研究

通過代謝組對植物代謝物積累模式的研究不僅可以了解植物代謝物的不同時空積累模式，而且還可以研究其成分及含量在不同環境條件下的變化，為進一步解析其生物合成及調控奠定基礎。代謝物的時空積累模式以研究具有生理、生物活性的次生代謝物最具代表性。類黃酮（flavonoids）是植物中普遍存在的一類次生代謝物，廣泛參與植物發育、生理等過程，對人體也有明顯保健作用，具有廣泛生理活性[43].

筆者所在的研究組通過靶向代謝組學手段檢測了水稻中超過90種類黃酮物質的時空積累模式，結果表明其中絕大多數在營養生長階段的葉中的含量最高。進一步研究表明，不同類型的類黃酮在水稻秈粳兩個亞種間的積累模式也存在著明顯的差異[44].酚胺（phenolamides）是廣泛存在于植物中另一類參與植物生長及脅迫響應的次生代謝物[45].筆者所在的研究組發現，與類黃酮不同，酚胺在根中高量積累，同時其在秈粳亞種間的積累模式也與類黃酮正好相反[13,46].由于上述兩類物質均在植物逆境響應過程中發揮作用，推測它們在水稻不同組織、不同亞種間的特異積累可能與水稻不同組織、不同亞種所受脅迫類型的不同有關。硫代糖苷（glucosinolates）是一類十字花科植物中特異的含硫代謝物，在抵抗生物脅迫過程中發揮重要作用[47].對模式植物擬南芥中硫代糖苷的研究不僅表明其積累具有明顯的時空特異性，還受到外界環境因子的調控，同時與不同生態型的地域適應性密切相關[16,48].上述代謝組學研究結果從一個側面說明了植物代謝物，特別是次生代謝物在植物的進化、亞種分化等方面的作用。

除此之外，通過對脅迫條件下植物體內各代謝產物進行定性及定量分析，從而發現植物逆境下代謝調控規律及網絡，也是植物代謝組學研究的一個重要方面。以非生物脅迫為例，植物在非生物脅迫下會啟動一系列生理、生化響應，代謝組學通過監測脅迫下代謝物種類、含量變化為揭示這些復雜響應提供了一個極好的平臺。Bowne等[49]研究了不同旱脅迫抗性的小麥品種在旱脅迫下的代謝變化。筆者所在的研究組利用廣泛靶向的代謝組學方法研究旱脅迫下水稻葉片的代謝物變化，結果表明旱脅迫能夠顯著提高脫落酸（abscisic acid）和包括脯氨酸（proline）在內的多種氨基酸、五羥色胺及其衍生物、部分酚胺及黃酮的積累，而溶血磷脂膽堿（lysophosphatidylcholines,LPCs）的含量則明顯下降[28].

Yamakawa等[50]發現水稻內源葡萄糖及ADP葡萄糖的含量在高溫脅迫下大量積累。大量研究揭示植物體內腐胺、亞精胺、精胺等多胺的含量與植物抗非生物脅迫能力顯著正相關[51~53],提示多胺在提高植物逆境抗性中發揮重要作用[54].

2.2 用于代謝物積累的遺傳基礎研究

解析遺傳變異如何控制性狀的表達是現代生物學研究的基本目標之一。由于植物代謝物對于植物及人類的重要性，植物生物學家一直致力于揭示調控植物代謝背后的遺傳基礎[12,55,56].植物樣品中代謝物含量作為代謝性狀（m-traits）往往也是受到多基因控制的數量性狀，代謝性狀的自然變異材料為研究其遺傳調控提供了難得的遺傳資源。通過數量性狀座位（quantitative trait loci）分析代謝性狀的自然變異有助于揭示控制這些變異的遺傳學基礎，解析代謝性狀形成的遺傳結構。目前絕大多數代謝性狀的遺傳學基礎研究都是通過兩個或少數幾個親本通過雜交或回交獲得的連鎖群體（linkage population）。例如，Schauer等[57]利用GC-MS技術進行番茄片段替換系（野生型番茄Solanum pennellii基因組片段由栽培種Solanum lycopersicum M82替換）代謝譜分析，共鑒定了控制74個已知代謝物的889個mQTLs.Matsuda等利用一個水稻回交群體（back-crossed inbred line,BIL）進行非靶向代謝組分析及代謝物QTL定位，獲得了802個代謝物QTLs（mQTLs）[58].對于擬南芥類黃酮[59]、硫代糖苷[16]等次生代謝物mQTL定位也獲得了部分具有顯著效應的位點。

傳統的mQTL定位都是基于限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）、簡單序列重復（simple sequence repeat,SSR）等低密度標記[15,60].利用這些標記定位了大量的代謝相關的遺傳位點。但是由于標記密度過低，很難直接獲得決定代謝物含量的候選基因[61].筆者所在的研究組首次將高密度連鎖圖譜應用mQTL研究中：利用廣泛靶向的代謝組學手段對一個獲得高密度連鎖圖譜的水稻重組自交系（recombinant inbred line,RIL）群體的兩個組織分別進行代謝譜分析及代謝物QTL（mQTL）作圖，共獲得了900個代謝性狀超過2800個mQTL[62].研究表明，水稻代謝組遺傳調控模式在不同組織中存在著很大的差異，具有明顯的組織特異性。對mQTLs的全基因組分布研究發現，代謝組的遺傳調控存在明顯的熱點區域，且熱點區域在不同組織中也不盡相同。在此基礎上通過對部分高精度（<100 kb）、大效應（解釋超過40%變異）位點的分析，獲得了24個控制代謝物含量變異的候選基因，并對其中部分基因進行了功能鑒定[62].

利用連鎖群體進行mQTL定位在植物代謝組學研究中已經得到廣泛應用。但是該方法存在著群體重組位點較少、群體構建費時費力、無法覆蓋多個不同品種等問題[61].近年來隨著高通量基因型鑒定技術的發展，利用全基因組關聯分析（genome-wide association study,GWAS）進行數量性狀定位研究在植物學研究中受到重視[63,64].筆者所在的研究組通過對水稻自然變異群體的代謝組學分析，揭示了水稻秈粳亞種間代謝譜差異，獲得了秈粳亞種分化的生物標志物（biomarker）[13].

進一步對代謝性狀進行全基因組分析（metabolic genome-wide association study,mGWAS），獲得了數百個控制代謝物自然變異的顯著位點。大部分代謝物的自然變異受到多個位點控制，但相比復雜的農藝性狀來說其遺傳結構相對簡單。
對秈粳亞種代謝組的遺傳分析表明，控制兩者的遺傳結構存在明顯差異，揭示了兩個亞種代謝組差異的遺傳基礎[13].

2.3 用于代謝相關功能基因鑒定及途徑解析

功能基因組學是后基因組時代一門重要學科，其主要任務就是鑒定每個基因的功能，其中就包括在基因組中占有相當大比例的代謝相關基因的功能。在過去10年中，通過代謝組學和其他組學，特別是轉錄組學的結合，大大加快了植物中代謝相關功能基因的鑒定。模式擬南芥擁有高質量的全基因組序列信息和非常完備的各類公共資源（包括cDNA全長序列、各種形式的突變體和豐富的轉錄組學數據信息等）及簡單而高效的遺傳轉化方法。這些都為利用代謝組學和轉錄組學的整合分析進行代謝相關基因（特別是那些缺失或過量表達并不能引起可見表型變化的基因）功能鑒定奠定了良好的基礎。通過對擬南芥代謝組、轉錄組的整合分析及后續的反向遺傳學驗證，成功鑒定了若干參與擬南芥類黃酮生物合成的基因。同樣的策略也成功的被用于參與花青素（anthocyanin）[65]及原花青素（proanthocyanidin）[66]合成基因的鑒定。除此之外，該策略還被成功的用于脅迫條件下代謝相關基因的克隆和鑒定[67].代謝組與基因組整合進行基因功能鑒定主要是通過關聯分析來實現，其原理是"共犯原則（guilt-by-association）",也就是說認為參與同一生物過程中的基因（或代謝物）通常是受同一個調控系統控制的[10].換言之，參與同一生物過程中的基因（或代謝物）有著相同或者相似的變化規律。這樣，如果你所感興趣的生物途徑中某一步基因其功能已被鑒定，通過對不同組學數據的關聯分析可以推測參與該生物途徑的其他基因，并可以利用反向遺傳學或生化手段進行功能驗證。隨著RNA測序（RNAseq）技術的發展，在非模式植物，如很多藥用植物中通過代謝組與轉錄組數據關聯分析也有不少成功的案例。Winer等[68]以罌粟（Papaversomniferum）為材料，通過對利用靶向代謝組學和RNA測序技術獲得的轉錄組數據的關聯分析，成功發現了一個參與嗎啡生物合成的基因簇（由分屬于5個酶家族的10個基因組成），并利用基因沉默技術鑒定了其中6個基因的功能。同樣利用"共表達"（co-expression）的研究策略，Seki等[69]從甘草（Glycyrrhiza uralensis）中鑒定了參與甘草甜素（glycyrrhizin）合成的兩個細胞色素P450基因。

另外，通過代謝組學與基因組學（第二代測序技術為代表的高通量測序）的結合進行代謝相關基因的克隆及鑒定則是該領域最新進展。筆者的研究組利用廣泛靶向的代謝組學手段對524份不同水稻品種中超過840個代謝物（已知和未知）進行定量分析，研究了水稻代謝組的自然變異[13].在此基礎上通過表型（代謝物含量）與基因型數據的全基因組關聯分析，預測了36個代謝相關基因的功能，并對其中的5個進行了功能驗證。在此基礎上重構了水稻中包括類黃酮、酚胺等在內的代謝途徑[13].與此類似，利用基于靶向代謝組學的代謝物全基因組關聯分析也成功預測并通過轉基因手段鑒定了水稻中參與酚胺合成的兩個?；D移酶編碼基因[46].

3 展望

代謝組學是系統生物學不可或缺的重要組成部分。植物代謝組學通過近年來的發展，特別是與基因組學、轉錄組學等其他組學技術的結合，已經在植物生理學、遺傳學、功能基因組學及相關生物技術研究領域發揮著越來越重要的作用，成為后基因組時代的研究熱點。植物代謝物在種類及含量方面的極端多樣性使得植物代謝組的研究顯得尤為重要。作為一門新興的學科，植物代謝組學還處于發展的初級階段，無論是在方法學還是在應用研究方面都還存在著亟待解決的問題。未來主要的發展方向包括：1）開發基于現有獨立分析平臺的更為廣譜、原位、即時、通用的檢測方法；2）建立實現多種分析平臺并行分析及數據整合的新型植物代謝組分析平臺，真正實現對植物樣本內代謝物的無偏性、高靈敏、高通量分析；3）開發準確、高效的植物代謝物鑒定或注釋工具；4）進一步實現代謝組學與其他組學（基因組、轉錄組、蛋白組、表型組等）數據的整合，以便更好地闡述生物過程的分子機理，同時促進其生物技術應用。