在自然環境下，兩棲動物受到紫外線、病原微生物的傷害及捕食者的威脅． 面對惡劣的自然環境，兩棲動物體表進化出許多特殊的腺體，這些腺體能夠分泌豐富多樣的生物活性肽，如抗氧化肽、抗菌肽、抗病毒多肽等，其中的抗菌肽研究已取得諸多進展． 有研究者僅從 Odorrana grahami 中就發現了107 種新型的抗菌肽． 目前已經發現的兩棲動物抗菌肽已有上千種，研究者根據沼水蛙抗菌肽的氨基酸序列，將其分成 brevinin、esculentin、nigrocin 和odorranain 等不同家族． 多種抗菌肽相互配合，快速有效地消滅病原微生物，成為兩棲動物生存繁衍的有效保障之一．沼水蛙學名 Hylarana guentheri，廣泛分布于中國南部和一些東南亞國家． 沼水蛙皮膚能夠分泌多種抗菌肽． 目前，已從沼水蛙皮膚分泌物中獲得分別屬于 brevinin、temporin 和 guentherin 家族的 9 種抗菌肽． 在不同的生活環境下，兩棲動物會分泌不同的抗菌肽來適應新的環境，沼水蛙抗菌肽的開發利用需要更多研究． 本文通過電刺激法獲取沼水蛙皮膚分泌物，利用凝膠過濾色譜和高效液相色譜進行分離純化，獲得了 1 種新的抗菌多肽 brevinin-2GHa1，并對其抗菌活性和溶液結構進行了研究．

1 材料與方法

1. 1 材料

野生成年沼水蛙捕捉于福建省福清，數量 n =18，體長 80 ～ 90 mm; 三氟乙酸\\( trifluoroacetic acid，TFA\\) 、三氟乙醇 \\( trifluoroethanol，TFE\\) ，購于德國CNW Technologies GmbH 公司; Sephadex G-50 凝膠過濾色譜填料購于美國 GE 公司; 甲醇和乙腈\\( 高效液相色譜純\\) 購于德國默克公司; 其它試劑均為國產分析純．LC-20A 島津高效液相色譜，Gemini 5 μ C18 反相高效液相色譜柱\\( 250 mm ×4. 6 mm\\) ，J-810 圓二色譜儀，XZ-21K 型高速冷凍離心機，FD-1C-50 冷凍干燥機，752 型紫外可見分光光度計，TSQ-280 培養箱，BS-160A 自動部分收集器，BT01-100 蠕動泵驅動器，MILLI-Q 型超純水機．

1. 2 沼水蛙皮膚分泌物抗菌肽的分離純化

提取沼水蛙皮膚分泌物: 電刺激法稍作修改． 市售 10 V 直流電池適度刺激沼水蛙耳后及背部腺體發達的部分皮膚，間隔 5 s 刺激 1 次，每次持續 1 s． 待實驗個體皮膚表面產生大量分泌物，采用 0. 05% \\( V/V\\) 三氟乙酸酸化，去離子水沖洗，收集沖洗液，離心 12 000 r/min，10 min，取上清液，置于-80℃冰箱迅速冷凍后做冷凍干燥處理，保存于-20℃備用．Sephadex G-50 凝膠過濾色譜: 去離子水溶解沼水蛙皮膚分泌物凍干粉，12 000 r/min 離心10 min．取上清液用 0. 22 μm 孔徑的微濾膜過濾． 濾液上樣用0. 5% \\( V/V\\) 的三氟乙酸水溶液平衡的 SephadexG-50 凝膠柱\\( 1. 6 cm × 100 cm\\) 分離． 洗脫液為 0. 5%\\( V/V\\) 的三氟乙酸水溶液，流速0. 3 mL/min，每10 min收集1 管洗脫液，于214 nm 波長檢測吸光值． 收集洗脫峰，冷凍干燥． 濾紙片法測定其抗菌活性，對有活性的組分進一步分離純化．反相高效液相色譜: 去離子水重新溶解具有抗菌活力凍干組分，離心 12 000 r/min，10 min，收集上清液，經 0. 22 μm 濾膜過濾并上樣至反相高效液相色譜． 液相色譜系統為 LC-20A，裝配 Gemini 5 μC18\\( 250 mm × 10 mm\\) 反相柱 \\( Phenomenex，UK\\) ．以含 0. 05% \\( V/V\\) 三氟乙酸的乙腈水溶液為流動相，進 行 梯 度 洗 脫，檢 測 波 長 214 nm，流 速 為1. 0 mL / min，洗脫時間 40 min． 洗脫梯度為: 0 ～5 min，20% 乙腈水溶液; 5 ～ 40 min，20%→70% 乙腈水溶液． 收集具有抗菌活性的峰，冷凍干燥后于-20℃ 保存備用．

1. 3 抗菌活性的測定

紙片法測定跟蹤樣品的抑菌活力: 所用菌種為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌． 具體操作如下: 挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，過夜振搖培養\\( 37℃，130 r/min\\) ． 取 200 μL 過夜培養物接種于 20 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養基中，振搖培養4 h \\( 37℃，130 r/min\\) 獲得菌懸液． 將菌懸 液 稀 釋 1 000 倍 作 為 測 定 活 性 用 菌 液． 取100 μL加入倒置的平板表面，涂布均勻，在平板表面貼直徑 5 mm 的濾紙片，濾紙片上加 10 μL 待測樣品，濃度為 5 mg/mL． 慶大霉素作為陽性對照，無菌水作陰性對照． 將平板倒置于 37℃ 恒溫培養18 ～ 20 h 觀察結果．最小抑菌濃度測定: 采用微量稀釋法測定樣品最小抑菌濃度\\( minimal inhibitory concentration，MIC，定義為顯著抑制細菌生長的最低濃度\\) ． 實驗所用菌種為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌\\( 上述菌種均為本室保存\\) ．菌種復蘇，接種斜面 37℃ 培養過夜，挑單菌落接種于普通 LB\\( Luria-Bertani\\) 培養基中，37℃ 培養過夜，稀釋菌液使菌濃度為 1 × 104～ 1 × 105CFU /mL 備用． 將抗菌肽溶液按 2 倍濃度稀釋，每孔抗菌肽體積為 100 μL，加入 100 μL 稀釋好的菌懸液混勻，使每孔抗菌肽的終濃度分別為 2. 0，3. 9，7. 8，15. 6，31. 3，62. 5，125，250 μg / mL． 將 96 孔板置于37℃ 過夜培養，酶標儀檢測 630 nm 波長的吸光值．當含有抗菌肽的培養液細菌生長濃度\\( A630\\) 與對照組培養液細菌生長濃度\\( A630\\) 比值小于 10% 時，認定抗菌肽在該濃度下對細菌有抑制作用． 能夠抑制細菌生長的最小濃度即為 MIC．

1. 4 沼水蛙抗菌肽一級結構測定

Edman 降解法是多肽和蛋白質測序中最可靠的方法之一． 根據埃德曼降解法原理，通過自動蛋白/多肽測序儀 \\( 島津，PPSQ-33A\\) 測定抗菌肽一級結構．

1. 5 沼水蛙抗菌肽溶液結構研究

在室溫下，用 J-810 圓二色譜儀測定樣品在不同溶液中遠紫外區的結構特征． 樣品池光徑 1 mm，掃描速度為 500 nm/min，掃描范圍為 190 ～260 nm，掃描狹縫寬度為 4 nm，連續掃描 3 次取平均值，除去樣品以外的相同溶液作為背景扣除． 試驗中樣品的終濃度均為 300 μg/mL．測定溶液對結構的影響: 采用去離子水、SDS水溶液\\( 10 mmol/L\\) 和 TFE\\( 100%\\) 為溶劑，測定樣品在不同溶液體系的圓二色譜特征．測定 TFE 濃度對結構的影響: 采用不同濃度TFE / H2O\\( 5% ，10% ，20% ，30% ，50% ，100% ，V / V\\)溶液配制樣品，測定樣品溶液在不同 TFE 濃度下的二級結構變化．

2 結果

2. 1 凝膠過濾色譜純化

將沼水蛙皮膚分泌物冷凍干燥后重新溶解，采用 Sephadex G-50 凝膠過濾色譜分離． 測定洗脫液214 nm 波長吸光值，繪制洗脫曲線． 如 Fig． 1 所示，沼水蛙皮膚分泌物經凝膠過濾色譜獲得初步分離，獲得 2 個組分 F1 和 F2．平板涂布法檢測組分 F1 和 F2 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用． 添加 F1 濾紙片周圍有明顯抑菌圈，表明 F1 對金黃色葡萄球菌\\( Fig． 2A\\)和大腸桿菌\\( Fig． 2B\\) 均有抑制作用，而添加 F2 濾紙片則未見抑菌圈，表明組分 F2 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無抑制作用． 故收集組分 F1 進一步分離純化．

2. 2 反相高效液相色譜純化

用 RP-HPLC 分離具有抗菌活力的 F1，收集了 6個組分\\( Fig．3\\) ，通過抗菌活性測定，發現峰 1 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用． 采用分析型C18 RP-HPLC 柱鑒定其純度，峰 1 具有較高的純度，因此選取洗脫峰峰1 進行序列測定．

2. 3 抗菌肽結構分析

用氨基酸自動分析儀測定其一級結構，獲得序列: Gly-Phe-Ser-Ser-Leu-Phe-Lys-Ala-Gly-Ala-Lys-Tyr-Phe-Leu-Lys-Gln-Val-Gly-Lys-Ala-Gly-Ala-Gln-Gln-Leu-Ala-Cys-Lys-Ala-Ala-Asn-Asn-Cys． 將 該 氨基酸序列與數據庫\\( http: / /www． ncbi． nlm． nih． gov/BLAST\\) 中收錄的抗菌肽序列進行比對，未發現相同序列，該抗菌肽為新型抗菌肽． 其序列和已知的brevinin-2GHa 序列高度相似\\( Fig． 4\\) ，屬于 brevinin-2 家族，將其命名為 brevinin-2GHa1． 同 brevinin-2GHa 相比，brevinin-2GHa1 的 C 末端少了 1 個丙氨酸\\( Ala\\) ，且第 13 位的苯丙氨酸\\( Phe\\) 和第 16 位的谷氨酰胺\\( Gln\\) 分別取代了 brevinin-2GHa 的亮氨酸\\( Leu\\) 和絲氨酸\\( Ser\\) ．為進一步研究 brevinin-2GHa1 結構特征，用蛋白質分析網絡服務器 NPS @ \\( http: / /npsa-pbil．ibcp． fr / cgi-bin / npsa _ automat． pl? page = / NPSA /npsa_seccons． html\\) 在線預測其二級結構． 該抗菌肽的 C 末端 2 個半胱氨酸形成二硫鍵，因此，截取brevinin-2GHa1 的 Gly1-Ala26 部分進行預測．預測采用 King 等提供的方法，經過服務器分析，brevinin-2GHa 和 brevinin-2GHa1 在 Ser3-Ala26 部分都形成了 α-螺旋結構\\( Fig． 4\\) ．根據 α-螺旋的結構特征，將該部分結構繪制成輪狀圖\\( Fig． 5\\) ． 由輪狀圖可知，brevinin-2GHa1的疏水氨基酸和親水氨基酸分別聚集于螺旋結構兩側，形成親水面和疏水面． 由抗菌肽兩親性的 α-螺旋結構推測，其作用位點可能是細胞膜．

2. 4 最小抑菌濃度測定

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌為檢定菌，測定 brevinin-2GHa1 的最小抑菌濃度\\( Table 1\\) ． 結果表明，brevinin-2GHa1 對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌都具有較強的抑制作用，而對沙門氏菌的作用較弱． 根據Zhou 等報道，brevinin-2GHa 僅對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑制作用，而對革蘭氏陰性菌大腸桿菌無抑制作用． 盡管 brevinin-2GHa1 與 brevinin-2GHa 只相差 3 個氨基酸，但是brevinin-2GHa1 的 抗 菌 活 性 卻 遠 強 于 brevinin-2GHa． 有研究表明，具 α-螺旋結構抗菌肽疏水性對其活性發揮重要作用，疏水性較高的抗菌肽具有較好的抗菌活性． Temporin A 的 α-螺旋結構疏水面的 2 個 Ile 如用疏水性更弱的 Ala 取代，結果temporin A 的抗菌活性降低至原來的 12. 5% 以下． 與此相反，將抗菌肽 temporin-1Dra 的 α-螺旋結構疏水面的 Leu9 或 Ile13，用疏水性更強的環己基甘氨酸\\( cyclohexylglycine\\) 取代后，其抗菌活性提高 2 倍． 由于 brevinin-2GHa1 疏水面僅由 5 個氨基酸構成，因此，螺旋結構疏水區疏水性的強弱將顯著影響其抗菌活性． Brevinin-2GHa1 的 α-螺旋內位于疏水面的 Phe \\( F13\\) ，其疏水性大于 brevinin-2GHa 中 Leu \\( L13 \\) 疏水性，這可能是 brevinin-2GHa1 比 brevinin-2GHa 抗菌活性更強，抗菌譜更廣的原因． 而 brevinin-2GHa1 疏水面不同疏水氨基酸的取代，對其活性影響的具體機制有待進一步研究．

2. 5 圓二色性研究

為了進一步闡明抗菌肽的抗菌機制，需要對抗菌肽在膜環境下的結構進行深入研究，常用的方法是測定多肽溶液在遠紫外區\\( 190 ～250 nm\\) 的圓二色譜吸收． 在此波長范圍內，肽鍵是主要的生色團，圓二色譜圖隨多肽二級結構的差異而呈現不同的特征形狀，由圓二色譜圖可以判斷多肽的折疊方式．SDS 為陰離子表面活性劑，在水溶液中可形成兩親的帶負電的膠束; TFE 可誘導和穩定多肽的螺旋結構，2 種物質的水溶液常作為細胞膜環境的簡單模擬． 本文研究了多肽在水、10 mmol/L SDS 溶液和 100% TFE 中的結構特征． 由 Fig． 6A 可知，在水溶液中，brevinin-2GHa1 圓二色譜在 202 nm 附近有 1 個負峰; 而在模擬膜環境的 SDS 溶液和 100%TFE 中，brevinin-2GHa1 的圓二色譜在 208 nm 和222 nm 波長的負峰明顯增強，圓二色譜吸收曲線呈“W”型． 圓二色譜圖從 208 nm 和 222 nm 波長的負峰吸收是 α-螺旋結構的特征吸收，在一定條件下，溶液中的螺旋結構含量與上述波長的負峰吸收正相關．

由圓二色譜圖可知，在水溶液中，brevinin-2GHa1 主要是無規卷曲狀態，在 SDS 和TFE 溶液中多肽主要是螺旋結構．TFE 分子中的 CF3基團使 TFE 呈現顯著的疏水性，可與多肽疏水性氨基酸相互作用，誘導多肽螺旋結構的形成; 隨著 TFE 濃度提高，TFE 聚集在多肽周圍形成包裹效應，從而穩定多肽的螺旋結構． 本文通過測定抗菌肽在不同濃度 TFE 溶液中的圓二色譜吸收，研究 brevinin-2GHa1 在不同疏水環境下構象變化． 由 Fig． 6B 可知，隨著 TFE 濃度升高，brevinin-2GHa1 溶液在 208 nm 與 222 nm 波長負峰吸收逐漸增強，表明隨溶液環境逐漸接近細胞膜環境時，brevinin-2GHa1 由無序的線性結構折疊成兩親的螺旋結構\\( Fig．5\\) ，抗菌肽螺旋結構比例逐漸上升．

3 討論

有研究表明，兩棲動物個體基因、生存環境和食物組成等方面的差異，可能導致兩棲動物皮膚分泌的抗菌肽不同，甚至同一兩棲動物個體在不同的生命周期分泌的抗菌肽各有差異． 兩棲動物抗菌肽豐富多樣，形成一個巨大的抗菌肽來源庫，具有重要的研究和應用價值．本文從沼水蛙皮膚分泌物中分離純化獲得的具有較強抗菌活性的抗菌肽 brevinin-2GHa1，它對革蘭氏 陽 性 菌 和 陰 性 菌 都 有 較 強 的 抑 制 作 用．Brevinin-2GHa1 屬于典型的 brevinin-2 家族，該家族抗菌肽最早從日本的黑斑蛙 Rana brevipoda porsa中分離獲得，并主要分布在亞洲和歐洲． 與其它家族相比，Brevinin-2 家族的序列同源性較差，序列中有 4 個保守氨基酸殘基 \\( Lys15、Cys27、Lys28和Cys33\\) ，主要結構特征是 C 端的 7 個氨基酸殘基形成 1 個由二硫鍵連接的環狀結構\\( Rana-box 模體\\) ．Brevinin-2GHa1 與 brevinin-2GHa 都是從沼水蛙中分離獲得的，并且二者的同源性很高，達到 90%，在C 端 都 有 2 個 半 胱 氨 酸 形 成 1 對 二 硫 鍵． 與brevinin-2GHa 不同的是，brevinin-2GHa1 的 C 端以半胱氨酸結束，是典型的 brevinin-2 家族抗菌肽的特征． 由于沼水蛙的生存環境和生命周期等原因，造成了兩者在序列上的差異，它們可能由相似的基因編碼． 盡管二者具有相似的序列，但是卻具有不同的抗菌活性．

相關研究表明，抗菌肽的活性與其分子量的大小、氨基酸種類及排布、電荷、疏水性和螺旋結構等相關． 關鍵氨基酸的取代對抗菌活性具有重要的影響．眾多研究對抗菌肽的抗菌機制提出了大量的解釋，其中抗菌肽結構的解析對抗菌機制的研究具有重要的推動作用． 研究表明，陽離子抗菌肽主要以α-螺旋結構穿膜，發揮抗菌作用． 為了闡明研究brevinin-2GHa1 可能的抗菌機制，采用圓二色譜方法研究其在不同模擬膜的環境中的二級結構． 結果表明，brevinin-2GHa1 在膜環境下折疊成 α-螺旋結構． 據此推測，當發揮抗菌作用時，brevinin-2GHa1先通過靜電作用吸附到帶負電荷的細菌細胞膜表面，然后在膜環境下折疊成兩親的 α-螺旋結構，從而干擾細胞膜磷脂層結構的穩定性，破壞細胞膜，最終導致菌體裂解死亡． 兩棲動物中抗菌肽分布廣泛，并且數量巨大，具有重要的研究價值． Brevinin-2GHa1 的研究結果不但豐富了沼水蛙抗菌肽的組成，并且對其抗菌機制的闡述提供了一定的結構基礎，為進一步開發利用提供了重要的實驗基礎．【圖略】

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