胰蛋白酶\\( trypsin，EC 3. 4. 21. 4\\) 是絲氨酸蛋白酶家族的成員，是許多生物技術領域的工具酶，如動物細胞培養過程，一些蛋白酶原活化過程等。在胰島素的生物合成過程中，通常是以胰島素原的形式表達，然后在體外通過羧肽酶 B 與胰蛋白酶的特異性切割，轉化為起作用的胰島素，但是目前所用到的胰蛋白酶大多數是從動物\\( 如豬、牛、羊等\\)的胰腺中直接提取，在此過程中，有可能引入 供體動物攜帶的致病微生物，所以急需重組胰蛋白酶的合成。在人體中，主要存在兩種胰蛋白酶原，即人胰蛋白酶原-1\\( trypsinogen-1，記為 PRSS1\\) 與人胰蛋白酶原-2\\( trypsinogen-2，記為 PRSS2\\) ，二者約占人體內胰液總蛋白的 19%，由于有研究報導 PRSS2 與人體的某些病理過程密切相關，所以本研究選擇PRSS1 作為研究對象，PRSS1 相對分子質量約為 24kDa，含有 247 個氨基酸，其中有 10 個 Cys。在其 N端 1 ～15 位氨基酸為胰蛋白酶原表達信號肽，16 ～23 位的 8 個氨基酸殘基\\( APFDDDDK\\) 是腸激酶的識別位點，也即胰蛋白酶原活化肽\\( Trypsinogen acti-vation peptide，TAP\\) ，在體內可被腸激酶切割成為具有活性的胰蛋白酶。Kiraly 等曾嘗試在大腸桿菌中直接表達胰蛋白酶原，未發現有目的蛋白分泌，通過用 Met 代替信號肽后，有以包涵體形式出現的蛋白，Chen 等在研究胰蛋白酶原活化肽的功能時，也用 Met 代替信號肽，可見，信號肽對于胰蛋白酶在大腸桿菌中的表達并非必須。若直接表達胰蛋白酶，由于其能夠特異性地在 Lys 與 Arg 的 C-端切割多肽，會對宿主造成很大傷害，也大大降低了目的蛋白的表達水平。本研究借鑒前人融合蛋白表達的優勢，將胰蛋白酶作為融合蛋白表達。

二硫鍵形成蛋白 A \\( Disulfide bond formationprotein A，DsbA\\) 最初是由 Bardwell 等于 1991 年發現，存在于大腸桿菌周質胞腔內，主要負責催化新生蛋白質二硫鍵形成。DsbA 在胞內與目標蛋白融合表達，有效地提高了目的蛋白的可溶性。

當然，不是所有的 DsbA 融合蛋白均能夠得到可溶性的目的蛋白。人源胰蛋白酶-1 富含二硫鍵，且在載體 pET-39b\\( + \\) \\( Novagen\\) 上含有催化二硫鍵形成的周質蛋白酶 DsbA 的基因，我們將人源 Tryp-sin-1 的基因片段連接到 DsbA 的 C-端，利用 DsbA與 Trypsin-1 融合表達，預期促進 Trypsin-1 蛋白中二硫鍵的正確折疊，實現目的蛋白的可溶性表達，并利用載體 pET-39b\\( + \\) 所攜帶的凝血酶的酶切位點來實現 Trypsin-1 的活化。

1 材料和方法

1. 1 材料

大腸桿菌 DH5α 與 BL21\\( DE3\\) 感受態及 EasyPfu DNA polymerase 購自北京全式金生物技術有限公司，載體 pET-39b\\( + \\) 購自 Novagen，Trypsin-1 全基因為北京奧科鼎盛生物科技公司合成。各種普通限制性內切酶為大連 Takara 有限公司產品; Fast-digest 內切酶與預染標準核酸相對分子質量蛋白為Fermaentas 公司產品; 質粒小量快速抽提試劑盒購自北京原平皓生物技術有限公司; 瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒為北京博邁德科技發展有限公司產品;預染標準核酸相對分子質量為康為世紀公司; 其余試劑為國產或進口分析純。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 Trypsin-1 全基因密碼子優化和二級結構分析

不同宿主對同一氨基酸有不同的密碼子偏好性，同時 mRNA 編碼區穩定性、外源蛋白的毒性對外源蛋白在原核中表達也有重要的影響。按照 Codon usage 網站提供的 E． coli 密碼子使用頻率表，對人源 trypsin-1\\( GenBank Accession No． NM_002769. 4\\) 的堿基進行優化設計，對密碼子使用頻率低的氨基酸進行同義突變。有文獻報導 mR-NA 二級結構的穩定性對翻譯起始效率起著至關重要的作用，進而影響蛋白的翻譯，我們用 RNAstruc-ture 軟件分析序列對應的 mRNA 的二級結構。

1. 2. 2 Trypsin-1 基因的擴增、克隆以及原核表達載體的構建

以含 Trypsin-1 基因的重組質粒 pGH-trypain-1為模板，設計引物進行 PCR 擴增，正向引物序列為5-aaaAGTACTATCGTTGGGGGCTATAACTG 反 向 引物序列為: 5-ccgCTCGAGTTATTAGCTATTGG CAG-CA。在正向引物和反向引物的兩端分別引入 ScaI和 XhoI 酶切位點。PCR 產物經純化后用 ScaI 和XhoI 30 ℃ 酶切 2 h，與同樣經 ScaI 和 XhoI 酶切的pET-39b\\( + \\) 質粒連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α 后采用菌落 PCR 法和雙酶切驗證法篩選陽性轉化子克隆，并送測序公司進行測序確定。測序正確的陽性克隆轉化子質粒 pET39b-trypsin-1，轉入感受態大腸桿菌 BL21\\( DE3\\) 菌種。

1. 2. 3 重組 Trypsin-1 的誘導表達與 SDS-PAGE分析

將 pET39b-trypsin-1/BL21\\( DE3\\) 重組菌接入含50 μg / mL 卡那霉素\\( Kan+\\) 的 LB 培養基中于37 ℃培養活化過夜，次日按 V\\( 活化菌液\\) ∶ V\\( LB 培養基\\) =1∶ 100 轉接至新鮮的 LB 培養基中，37 ℃培養至 OD600 為 0. 6 左右，加入誘導劑 IPTG，24 ℃進行誘導，220 r/min 振蕩培養 8 h。

取 100 mL 菌液，以 8000 r/min，在 4 ℃條件下離心 10 min 收集菌體，用溶液\\( 50 mmol/L Tris-HCl100 mmol / L NaCl pH = 8. 0\\) 洗滌菌體 3 次后，離心并重懸菌體，17% 的功率超聲裂解 20 min。分別將裂解上清液、沉淀通過 SDS-PAGE 電泳分析，其中分離膠濃度為 15%，濃縮膠濃度為 5%，電泳后以考馬斯亮藍 R-250 染色，凝膠薄層掃描，分析目的蛋白表達情況。并嘗試不同的發酵溫度、誘導劑量、誘導時機以及裝液量，確定最適宜培養條件。

1. 2. 4 Trypsin-1 包涵體的復性

離心收集到的菌體，按 1 L 發酵液所得菌體用20 mL 50 mmol / L Tris-HCl 重懸，8 000 r / min，4 ℃ 離心 5 min，洗滌 3 次，然后用 20 mL 50 mmol/L Tris-HCl 重懸混勻，冰上放置 30 min，17% 的功率超聲裂解 20 min，4 ℃，12 000 r/min 離心 30 min，棄掉上清，用包涵體洗滌液\\( 3 mol/L 尿素，0. 6% Triton-X100，50 mmol / L Tris-HCl，4 mmol / L EDTA\\) 重懸沉淀，洗滌 30 min; 12 000 r/min 離心 30 min，棄掉上清，用包涵體洗滌液再洗 1 次，離心棄上清; 沉淀用5 mL 變性液\\( 50 mmol / L Tris-HCl，10 mol / L 尿素，40 mmol / L DTT，1 mmol / L EDTA\\) 充分溶解 3 h，4 ℃ ，12 000 r / min 離心 30 min，回收上清; 將復性液\\( 50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/LGSSG，5 mmol / L CaCl2\\) 緩慢加入到變性的蛋白溶液中，至尿素終濃度為 2 mol/L，4 ℃復性 12 h。復性完畢后，以50 mmol/LTris-HCl，5 mmol/L CaCl2緩沖液 4 ℃透析。

1. 2. 5 Trypsin-1 活性測定

Trypsin 的活性定義為以 N-苯甲?；?L-精氨酸乙酯 鹽 酸 鹽 \\( BAEE \\) 為 底 物，用 pH 值 7. 8，0. 050 mol / L Tris-HCl 緩沖液配置 1. 0 mmol / L 底物溶液，光程 1 cm，反應溫度 25 ℃，波長 253 nm 的條件下，OD 值遞增 0. 001 min－ 1，為 1 個 BAEE 單位。

酶活力單位\\( BAEE 單位\\) = ΔOD/t × 1000。

并以市售豬胰蛋白酶\\( 北京索萊寶科技有限公司\\) 為對照: 2. 5 g 豬胰蛋白酶和 0. 2 gEDTA 溶于1 L PBS 中，不含鈣和鎂，含酚紅，過濾除菌，－ 20 ℃保存，活性 250BAEE 單位 mg－ 1。

取 200 μL 復性蛋白液與 20 μL 凝血酶切割緩沖液\\( 10 × Buffer: 200 mmol/L Tris-HCl，pH = 8. 4，1. 5 mol / L NaCl，25 mmol / L CaCl2\\) 混合，加入 1 μL凝血酶，室溫酶切后取 200 μL 酶切溶液測定其活性。

2 結果

2. 1 Trypsin-1 基因表達質粒的構建

構建的重組表達質粒 pET39b-Trypsin-1，經菌落PCR［圖 1a\\) ］和雙酶切［圖 1b\\) ］驗證，得到 678 bp左右的特異性擴增條帶，經測序驗證，結果顯示與所要構建的目的基因片段完全一致?！緢D1】

2. 2 Trypsin-1 在大腸桿菌 BL21\\(DE3\\)中的表達

pET39b-Trypsin-1 / BL21\\( DE3 \\) 經 IPTG 誘導的菌液裂解物與未誘導的同樣菌液裂解物在 15% 的SDS-PAGE 電泳圖上對照分析\\( 圖 2 \\) ，可以看到小于 55 kDa 處有 1 條明顯的表達蛋白帶，但是目的蛋白主要以包涵體的形式出現在沉淀中，分子質量與理論計算的相符。優化后的搖瓶發酵條件為37 ℃，220 r / min，500 mL 搖瓶中裝液量為 100 mL，IPTG誘導 10 h 包涵體量達到最大，融合蛋白約占菌體總蛋白的 40%。IPTG 的濃度對蛋白表達影響較小，試驗中用量為 0. 5 mmol/L。

2. 3 Trypsin-1 的親和純化

重組融合蛋白 DsbA 與 Trypsin1 之間含有 6XHis·Tag，其與金屬 Ni 離子具有親和作用，以 Ni-NTA 交聯的瓊脂糖作為層析介質，對超聲裂解離心后的上清液柱上純化，多次試驗發現洗脫峰中沒有目的蛋白，其中也曾嘗試用更低的溫度 \\( 20 和16 ℃ \\) 誘導表達也未發現有目的蛋白洗脫下來。說明對于人源的胰蛋白酶，單獨的與 DsbA 融合表達，不能實現融合蛋白可溶性表達的目的。改用對包涵體變性和復性的方法得到目的蛋白。

2. 4 Trypsin-1 的活化和胰蛋白酶活力的測定

用紫外分光光度計測量 ΔOD253來檢測融合蛋白復性后經凝血酶活化獲得的胰蛋白酶活性，15%SDS-PAGE 結果分析見圖 3。酶切 12 h 后，復性的融合蛋白基本被切開，活性達到最大，為 4 個 BAEE活力單位。對于市售豬胰蛋白酶，相當于 1 L 發酵液獲得有 1. 6 mg 有活性的目的蛋白。

2. 5 重組基因表達的 mRNA 二級結構軟件分析結果

用 RNAstructure 軟件分析了經過密碼子優化后重組基因對應的 mRNA 的二級結構，圖 4 優化后在翻譯起始部位的堿基配對比優化前明顯減少了，這樣有利于翻譯效率的提高。

3 討論

不同來源的 Trypsin 基因片段在不同的宿主菌中已成功構建，其中在 Pichia Pastoris 中實現了豬源、牛源Trypsin 的可溶性表達，但是產量都并不高。其中在 E． coli 表達人源胰蛋白酶源-1，由于其富含二硫鍵，目前所獲得產物主要以包涵體的形式出現，通過體外重折疊所獲得的有活性的胰蛋白酶，得率相當低。但是 E． coli 由于發酵周期短、遺傳背景清楚、成本低廉等優勢，更被傾向優先作為宿主菌。本實驗用所構載體 pET39b-tryp-sin-1 轉化 BL21 \\( DE3 \\) 經 IPTG 誘導表達及發酵條件優化后，雖然沒有實現預期的可溶性表達，但是在包涵體中實現了 DsbA-Trypsin 的大量表達。

所得沉淀超聲破菌后經緩沖液的洗滌、變性、復性，用凝血酶切割，得到了有活性的胰蛋白酶，說明部分胰蛋白酶形成了正確的構象。以市售的豬胰蛋白酶為參照\\( 2. 5 g/L，250 U/mg\\) ，每 1 L 發酵液獲得了約 1. 6 mg 有活性的 Trypsin，復性過程操作簡便，適合放大過程。包涵體的復性與復性起始蛋白濃度、溶液的 pH 值、緩沖液的組分等條件有關，從圖 3 中可以看出本實驗在包涵體變性方面損失了大量的蛋白，在復性方面有待做進一步的探索。

本試驗通過包涵體表達獲得了大量的胰蛋白酶，由于胰蛋白酶有較多的二硫鍵，通過包涵體的洗滌、變性和復性，最后得到的有活性的蛋白得率較低。和包涵體蛋白復性相比，純化可溶表達蛋白相對更節約成本和時間，利于放大生產，目的蛋白得率也較穩定和較高。本實驗室利用載體 pET-39b\\( + \\) 在 E． coli BL21\\( DE3\\) 中已成功表達了可溶性的牛腸激酶輕鏈 EKL片段，但是通過本試驗證明同樣的手段并不適用于人源胰蛋白酶的表達。本試驗為后續在 E． coli 中探討人源胰蛋白酶的可溶性表達可以提供一定的借鑒，如另有文獻報道 Ds-bA 的突變型與真核蛋白 IGF-I，3C 蛋白酶，TGFβ-2和 GFP 等蛋白融合表達，有效的提高了目的蛋白的可溶性，值得嘗試。此外，本試驗表達的胰蛋白酶主要用于工業生產胰島素原的激活反應，所以沒有進行進一步的純化試驗，而直接用于胰島素原的切割，這樣可以減少多步純化工序，節約成本。