糖基化磷脂酰肌醇\\( glycosylphosphatidylinositol\\( GPI\\) -錨定蛋白\\( APs\\) 是一類通過羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇錨定在細胞表面而不跨越膜磷脂雙層的細胞膜蛋白． 該類蛋白廣泛分布在真核細胞表面，獨特的結構使其具有水解酶、受體、粘附分子、補體調節蛋白等多種功能． 精子表面 GPI-APs 在精子發生、精子成熟、精子免疫保護、獲能及頂體反應、精卵識別、男性不育及生育等生理及病理過程中發揮重要的作用，但精子表面 GPI-APs 的鑒定研究尚不充分和系統． 嗜水氣單胞菌毒素\\( aerolysin\\) 是由革蘭氏陰性嗜水性氣單胞菌分泌的外毒素，能與GPI 錨蛋白的 GPI 錨基和 N-glycan 的多糖核心特異性結合． 本研究引入這種能特異性識別 GPI-APs 的細菌毒素作為蛋白生物探針，通過三明治蛋白印跡及免疫熒光的方法鑒定精子表面的 GPI-APs．

1 材料與方法

1. 1 材料

嗜水性氣單胞菌株購自中國科學院水生生物研究所; 標準嗜水性氣單胞菌毒素\\( proaerolysin\\) 購自加拿大薩省大學; 熒光標記的嗜水性氣單胞菌毒素FLAER\\( Alexa-488 Proaeroysin\\) 購自加拿大 Protox 公司; 嗜水性氣單胞菌毒素多克隆抗體\\( 兔源多抗\\) 自制; 堿性磷酸酶標記 Protein A/G、PVDF 膜\\( 0. 45μm\\) 購自 Pierce 公司; 蛋白酶混合抑制劑\\( ProteaseInhibitor Cocktail Set Ⅲ\\) 購自 Calbiochem 公司; 酵母提取物、胰蛋白胨\\( Tryptone\\) 購自 OXOID 公司; 弗氏完全佐劑\\( Freund adjuvant complete\\) 、弗氏不完全佐劑\\( Freund adjuvantincomplete\\) 、TX100、TX114 及PEG20 000 購自 Sigma 公司; 蛋白預染 Marker 購自Fermentas 公司; 硫酸銨\\( 分析純\\) 購自北京化學試劑公司; 其余試劑均為國產分析純． Sephadex G-100、1. 5 × 100 cm 層析住、2 × 50 cm 層析柱以及 AKTA蛋白色譜純化及回收系統購自 GE 公司; Spectrapor透析 袋 \\( 分 子 截 留 12 000 ～ 14 000 kD\\) 購 自Spectrum 公司，熒光顯微鏡購自 Nikon 公司． 新西蘭雌性長耳兔購買于北京大學醫學部實驗動物中心．

1. 2 毒素制備———菌株復蘇與擴大培養

無菌吸管吸取0.3 ～0.5 mL 營養肉湯加入到裝有真空冷凍干燥的菌種安瓿管內，凍干菌株溶解呈懸浮狀． 吸取全部菌體懸液，移植于斜面培養基中，30℃培養箱中培養36 h 后，挑取乳白色菌苔用連續分區劃線法接種至培養皿中，繼續培養24 h． 挑取培養皿中單個菌落，研磨法接種于盛有5 mL LB 肉湯培養基的50 mL滅菌離心管中，在30℃恒溫振蕩器中\\( 150 r/ min\\) 培養12 h 后倒入 250 mL LB 肉湯培養基，繼續培養 36 h，菌液離心3 000 r/min，15 min，上清回收待用．

1. 3 毒素提純

回收的菌液上清在冰浴條件下，采用硫酸銨沉淀法初步提純回收毒素． 然后用 Sephadex G-100色譜柱純化毒素，色譜條件: 平衡液及洗脫液均為50 mmol / L Tris-HCl，pH 7. 8 緩沖液，流速 12 mL / h，按 4 mL/管收集，上樣量為柱體積 5% \\( 即為 6 mL粗提毒素，上樣濃度為 5 ～10 mg/mL\\) ． 紫外 280 nm進行檢測，回收吸收峰段的樣品即為提純的毒素，提純的毒素裝入透析袋埋入 PEG20 000 中濃縮．

1. 4 兔抗毒素多克隆抗體制備

用嗜水氣單胞菌毒素\\( aerolysin\\) 免疫雌性成年新西蘭大耳兔，首次免疫后每隔 2 周加強免疫 3 次，首次免疫將弗氏完全佐劑乳化，加強免疫以弗氏不完全佐劑乳化，每次免疫的毒素蛋白量約為0. 1 mg．3 次加強免疫后，耳緣靜脈無菌取血，Western 印跡檢測血清抗體的效價，第 8 周再加強免疫 1 次，2 周后頸總動脈取血制備血清．

1. 5 大鼠精子膜脂筏成份提取

分離收集大鼠附睪尾部精子，調節精子懸液濃度至 50 ×106cell / mL，用 TX114 膜蛋白提取液提取大鼠精子膜蛋白，冷丙酮沉淀濃縮備用．

1. 6 多克隆抗體的 Western 印跡鑒定

純化后的 aerolysin 進行 12% SDS-PAGE，蛋白電轉移至 PVDF 膜，以溶解于 TBS 的 5% 脫脂牛奶，室溫封閉 30 min，用上述制備的多克隆抗體以及陰性對照血清\\( 免疫前\\) 4℃孵育過夜． TBS-T 洗膜，以堿性磷酸酶標記的羊抗兔 IgG 室溫孵育 2 h，洗膜后以 BCIP/NBT 顯色試劑盒顯色．

1. 7 精子膜表面 GPI 錨蛋白鑒定

1. 7. 1 Sandwich Western 印跡鑒定精子膜表面 GPI錨蛋白 上述提取到的精子膜蛋白進行 12% SDS-PAGE，電轉移至 PVDF 膜，以溶解于 TBS 的 5% 脫脂奶粉室溫封閉 30 min，加入制備的毒素\\( 5% TBS脫脂奶粉 1∶ 500 稀釋\\) 4℃孵育過夜，TBS-T 洗膜，加入上述制備的多克隆抗體\\( 稀釋同前\\) 室溫 4 h，TBS-T 洗膜，以堿性磷酸酶標記的羊抗兔 IgG 室溫孵育 2 h，洗膜后以 BCIP/NBT 顯色試劑盒顯色．

1. 7. 2 免疫熒光檢測精子膜表面 GPI 錨蛋白 取大鼠附睪精子，用 4% 多聚甲醛 4℃靜置過夜，充分固定精子，調整精子密度為 1 × 106cell / mL． 按1∶ 100比例將 FLAER 加入到精子懸液，避光冰上孵育1 h，然后加入 PI 襯染液，繼續避光冰上孵育1 h．孵育結束用預冷的 PBS 洗滌后重懸精子，取 20 μL精子懸液均勻涂在載玻片上，干燥后用含 2% 抗熒光淬滅劑的甘油封片液封片，熒光顯微鏡油鏡下觀察并記錄圖像資料: 激發波長 490 nm．

2 結果

2. 1 嗜水氣單胞菌菌株復蘇培養

凍干菌株經斜面培養管復蘇并接種到普通營養肉湯培養皿中，30℃培養 24 h 后，培養皿中長出單個2 mm 左右凸起的灰白色光滑濕潤的菌落\\( Fig． 1\\) ，菌落有淡香氣味．

2. 2 嗜水氣單胞菌毒素的提純

經過 Sephadex G-100 色譜柱對硫酸銨分級沉淀的嗜水氣單胞菌毒素提純，發現在 2. 5 h 時開始出現洗脫峰，至 4 h 時洗脫峰降至基線附近，洗脫峰為單一峰值\\( Fig． 2\\) ． 洗脫液濃縮后的 SDS-PAGE 圖譜顯示在 45 kD 附近有一明顯蛋白條帶\\( Fig． 3\\) ．【2】

2. 3 多克隆抗體效價的 Western 印跡鑒定

Aerolysin 多克隆抗體與嗜水氣單胞菌毒素提純液及購買的毒素雜交后，均在毒素蛋白相應位置\\( 40 ～55 kD\\) 出現明顯條帶，陰性對照血清與毒素雜交后未出現相應條帶\\( Fig． 4\\).

2. 4 精子膜表面 GPI 錨蛋白的鑒定

2. 4. 1 精子膜脂筏成分的 Sandwich Western 印跡

結果 嗜水氣單胞菌毒素和制備的 aerolysin 多克隆抗體與 2%TX114 裂解液提取的精子膜蛋白脂筏成份經過 Sandwich Wester-blot 雜交后，在10 ～130 kD之間出現明顯 12 條左右的蛋白條帶，且本實驗純化的毒素及購買的標準毒素識別的蛋白條帶分子質量位置一致\\( Fig． 5\\) ．

2. 4. 2 精子表面 GPI 錨蛋白的 FLAER 熒光檢測

使用 FLAER\\( Alex488 標記的 aerolysin\\) 直接標記附睪頭部和尾部精子后，熒光顯微鏡下可看到在精子的頭部和鞭毛段均有 GPI 蛋白分布\\( Fig． 6\\) ．

3 討論

嗜水性氣單胞菌是革蘭氏陰性球桿狀細菌，屬于致病菌，是導致魚類死亡的主要菌類，其所含嗜水氣單胞菌毒素\\( aerolysin\\) 能特異與 GPI 錨基的糖鏈結合． 由于目前尚無市售的 aerolysin，本實驗通過嗜水性氣單胞菌株培養物經蛋白質化學技術及原理純化了嗜水氣單胞菌毒素，自制了兔抗嗜水性氣單胞菌毒素多克隆抗體． 通過與國外大學制備的標準毒素比較，確認了純化毒素及自制抗體的特異性的有效成份與純度． 并使用純化毒素和自制抗體對精子表面 GPI 錨蛋白進行初步鑒定． 本實驗結果顯示，自制的兔抗嗜水氣單胞菌毒素多克隆抗體效價高\\( 工作濃度為 1∶ 1 000\\) ，特異性好，可以用于后期的實驗．

本研究驗證了理論假說: 嗜水氣單胞菌毒素能識別精子表面的 GPI-APs，并為精子表面GPI-APs 的深入研究提供了實驗材料及方法基礎．精子表面的 GPI-APs 部分是在精子發生過程中由精子細胞自行合成并表達的，其它的精子表面GPI-APs 則是轉移并整合到精子表面的． 雄性生殖管道中，附睪在精子成熟、貯存和保護中起重要作用，附睪上皮細胞合成并分泌各種蛋白質，包括很多 GPI-APs，它們通過微囊泡\\( 附睪小體\\) 轉運，整合到精子細胞膜表面，使精子獲得新的蛋白成分． 本實驗中使用 FLAER 直接標識精子表面的GPI-APs，為 GPI-APs 的鑒定及細胞定位提供初步信息．

結果\\( Fig． 6\\) 顯示，附睪頭段和尾段熒光強度的不同也在一定程度上驗證了附睪精子從附睪頭運行至附睪尾時，有新的 GPI 錨蛋白成份添加到精子表面，主要分布在精子頭部及精子尾部． 但是精子在附睪的穿行中，移行 GPI-APs 的定位、結構、功能及其具體機制有待進一步研究．

本實驗探索性地對精子表面的 GPI-APs 進行了初步分析． 研究結果表明，嗜水氣單胞菌毒素能夠有效識別精子表面的 GPI-APs，驗證了其可以作為生物探針鑒定精子表面的GPI-APs 的假說; 同時，還制備了后期實驗所需的主要實驗工具，為 GPI-APs 蛋白的鑒定及功能研究奠定了基礎．