摘要：納米孔是目前單分子測序的一項重要技術。作者以氮化硅絕緣材料為基底，采用微加工技術設計和制備了自支撐氮化硅懸空膜結構，然后利用聚焦離子束刻蝕懸空膜。通過優化聚焦離子束的系統參數，得到一系列孔徑和錐度可控的納米孔。通過掃描電鏡和電學信號顯示，該納米孔具有很好的表面特性和伏安特性。當加入DNA分子時，電流瞬時下降，得到一系列明顯、穩定的阻塞信號。說明該方法制備的納米孔穩定可靠，可以用于不同生物分子的檢測和分析。
關鍵詞：氮化硅；聚焦離子束；納米孔；阻塞電流
納米孔作為一種新型的納米探測器，是單分子檢測的一項重要技術，其低成本、高通量的特性成為DNA超快速測序實現的關鍵技術之一。1996年，Kasianowicz等人首次報道了α-溶血素（α-HL）蛋白質納米孔，并檢測出DNA和RNA分子過孔產生的阻塞電流。
此方法一經提出，就引起了廣泛的關注，也是生物膜上各種通道轉變為納米孔的開端。不過，由于生物納米孔脆弱、不穩定、孔徑無法隨意控制，限制了它的廣泛應用。隨著微加工技術的發展，固態納米孔應運而生。2001年，Li等人首次利用自制的離子束反饋控制系統在Si3N4薄膜上刻蝕出納米孔，用于DNA檢測。隨后，Dekker小組利用300kV的高能聚焦電子束（focusionbeam,FIB）在SiO2薄膜上刻蝕出納米孔。隨著研究的日趨升溫，更多制備固態納米孔的方法陸續出現，如應用聚焦電子束誘導刻蝕、低能電子束刻、激光束光刻、電化學腐蝕等方法，在氮化硅、氧化硅或其它金屬氧化物等薄膜介質上制備出穩定的納米孔。為了得到更小的孔，通過原子沉積、離子束沉積、高能電子束液化等進行縮孔的技術也得到發展，以滿足納米孔的應用。
同時，制備納米孔的材料也更加廣泛，從氧化硅等金屬氧化物，到塑料、玻璃、石墨烯等高分子化合物，都成為固態納米孔的加工材料。固態納米孔具有穩定性好，尺寸可控，表面特性可調等優勢，已成為目前單分子檢測領域的研究熱點。
不過，固態納米孔的制備工藝目前仍然比較復雜，成功率和穩定性有待提高，納米孔的形貌特征也直接影響著納米孔器件的靈敏度和可靠性。因此，發展一種簡單、可靠的納米孔制備工藝是目前納米孔器件發展的關鍵。本文以氮化硅絕緣材料為基底，采用微加工技術設計和制備了自支撐的氮化硅懸空膜結構，然后，利用聚焦離子束（FIB）刻蝕懸空膜。
通過優化聚焦離子束的系統參數，得到一系列孔徑和錐度可控的納米孔。制備好的納米孔置于膜片鉗檢測裝置中，顯示出良好的伏安特性。當加入DNA分子時，電流瞬時下降，得到一系列明顯、穩定的阻塞信號。這些結果表明，本文采用的固態納米孔的制備工藝是切實可行的，該方法制備的納米孔可以用于不同生物分子的檢測和分析，促進其在基因測序，生物傳感等領域的廣泛應用。材料和方法材料采用4寸晶圓、厚310μm、<100>型雙面拋光的單晶硅片為基片，先后通過低壓氣相沉積分別沉積500nmSiO2和100nmSi3N4薄膜。所用硫酸、過氧化氫、氫氟酸、氫氧化鉀、氟化銨、乙醇和丙酮等試劑均為分析純，所用溶液均為去離子超純水配置（Millipore,>18MΩ/cm）。Si3N4膜懸空結構的制備以4寸晶圓、厚310μm、<100>型雙面拋光單晶硅片為基底，通過濕氧化和低壓氣相沉積，分別沉積500nmSiO2和100nmSi3N4的薄膜，然后，腐蝕或刻蝕形成Si3N4膜懸空結構。
掩模版圖形的設計在腐蝕或刻蝕的過程中，利用傳統的光刻技術，先在基片上均勻地甩上一層抗蝕劑（也稱光刻膠），然后，通過掩模版在各種波長的光下曝光，將掩模版上的圖形轉移到光刻膠上。
各層膜的制備將基片清洗干凈后，通過濕氧化的方法在硅片雙面生長約500nm厚的SiO2層，作為過渡層。然后，用化學氣相沉積的方法將Si3N4膜沉積在雙面SiO2膜上。各層膜的腐蝕為了進一步得到Si3N4膜的懸空結構，需要去除掉部分Si和SiO2形成的Si3N4懸空結構。膜腐蝕加工過程如圖1所示。
（A）掩膜版圖形的轉移：在已沉積了膜的Si基片的一面，利用甩膠機均勻地甩上一層光刻膠（正膠），用紫外光進行曝光，使暴露在光下的光刻于FIB的納米孔制備本文采用FEI公司生產的聚焦離子束加工系統，型號為StrataFIB201,可利用離子束刻蝕出納米級或微米級的一維或二維結構，以及一定深度的三維結構，或者用離子束誘導化學氣相沉積方法沉積納米及微米級的金屬與介電質結構材料。儀器所使用的軟件為FEI'sxP2.25,采用Ga69液態金屬離子源，加速電壓為5~30kV;離子束流強度為1~11500pA（分10檔）；離子束成像分辨率為7nm（1pA、30kv）；樣品臺直徑為50mm;離子束通道的真空度保持在10-4Pa,采用spot打孔模式。實驗樣品為自制的氮化硅懸空薄膜，通過設定不同的FIB作用時間，制備不同孔徑的納米孔，然后通過掃描電鏡（scanningelectronmicroscope,SEM）成像系統對納米孔進行表征和分析。
當施加電壓后，電場分布在納米孔及其附近。電流信號通過16位的DAQ數字卡采集，采樣頻率為10kHz.為了去除電磁噪音，整個流體裝置放入Faraday屏蔽箱。DNA分子加入負極的室內后，在電場驅動下，從負極向正極運動，進入納米孔的捕獲區。DNA過同一納米孔的信號經過多次實驗重復，過孔事件通過Labview記錄并用Matlab軟件分析。
結果和討論
SEM表征納米孔FIB是一種極具潛力的納米加工工具，可用于離子束曝光、刻蝕、輔助沉積或注入摻雜等。
本文采用FIB在氮化硅懸空薄膜上打孔，通過設定不同的打孔時間，制備得到十幾到幾百納米的孔。如圖3顯示，當FIB作用時間為15、10、5、3和1s時，分別得到孔徑為41.60、37.94、32.68、26.9和16.67nm的納米孔。作用時間太短時，如0.3s,薄膜未能被擊穿。通過大量的實驗，我們發現當保持離子加速電壓和離子束電流不變，隨著FIB作用時間的增加，制備的納米孔的孔徑會不斷增大。但孔徑的增大和作用時間不是簡單的線性關系。隨著作用時間的增加，孔徑增加的速度逐漸減小。當時間足夠長時，孔徑并不會無限地增大，而是趨于一個穩定的值。通過對不同厚度的氮化硅薄膜打孔分析，我們發現這一規律同樣適用。當離子束電壓、離子束電流、離子束通道真空度為定值時，孔徑的大小變化與作用時間有關，與薄膜的厚度無關。
通過SEM電鏡測得的錐形孔的孔口和孔底直徑，以及薄膜厚度，我們得到了納米孔的錐度角。如圖4所示，在設定的打孔條件下，隨著離子束作用時間的增長，雖然孔徑在增大，但納米孔的錐度角卻越來越小，最終趨近于72°角。這和離子束的能量及入射角等因素是相關的。聚焦離子束中鎵離子束的能量分布并不是一個嚴格的點，而是呈高斯分布，離子束中央部分能量較高，然后，逐漸向邊緣遞減。此外，打孔時，離子束聚焦的位置和離子束的束徑也會影響到納米孔的形貌。
當在納米孔兩側施加一系列不同強度的正、負電場時，電解質溶液通過納米孔作定向運動，得到不同的離子電流。圖5A為溫度為25℃時，不同孔徑的納米孔在1mol/L的KCl溶液條件下得到的伏安特性曲線，可見孔徑增大，得到的離子電流也增大。
納米孔具有一定的整流效應，這主要是由于納米孔有限的空間使得通過的離子同孔壁表面的電荷發生相互作用，產生了離子優先選擇性。當然，離子電流的整流特性不僅與納米孔的形狀有關，而且還與溶液成分、溶液濃度和pH值等因素有關。
另外，我們對納米孔的電信號進行了理論預測，發現當納米孔處于電解質溶液中時，薄膜兩側的電極所測得的響應電流和檢測系統的電阻有關，主要包括溶液的電阻及納米孔本身的電阻。根據Hall對柱形納米孔的電阻理論，我們對錐形納米孔的電阻進行了估算。
從圖中可以看出，單位時間內DNA過孔的通量比較高，可達到檢測的目的。阻塞信號主要通過阻塞電流（currentblockage）和易位時間（transitiontime）來表征。阻塞電流是DNA分子在納米孔中由于體積阻塞效應引起的電流的急劇下降；易位時間是DNA分子穿過納米孔的時間，主要包括在孔口捕獲區與孔相互作用進入納米孔及在納米孔內運動的時間。通過對大量過孔事件的統計，得到了如圖6B和C所示的阻塞信號的分布直方圖。從圖中可以看出，阻塞電流和易位時間分別呈高斯分布和泊松分布。
當電壓為400mV時，阻塞電流為170pA,易位時間分布在1~10ms.易位時間比DNA通過更小孔（如10nm和~200-800μs）的時間要長，這可能是因為DNA與納米孔之間的相互作用引起的。隨著驅動電壓的增大，阻塞電流逐漸增大，同時過孔速度加快，易位時間減少?？紤]到目前DNA過納米孔測序的主要問題之一就是過孔速度過快，直接影響到過孔信號的采集。因此，我們在增大電壓、提高DNA過孔的通量和阻塞電流強度的同時，也要考慮到DNA分子過孔的速度?？偨Y本文利用聚焦離子束在氮化硅薄膜上刻蝕納米孔，發現通過改變打孔時間等聚焦離子束的系統參數，可以制備出孔徑和錐度可控的納米孔，以滿足不同生物分子檢測的需求。
該方法簡單、可靠，制備的成功率比較高。通過SEM和電學信號顯示，該納米孔具有很好的表面特性和伏安特性。同時，我們利用制備的納米孔對DNA分子進行實驗，得到了較高的過孔通量和阻塞信號，進一步證明了基于FIB的氮化硅納米孔加工工藝的可靠性。隨著固態納米孔制備工藝的不斷完善，納米孔有望發展成為一種方便、快速、廉價的單分子檢測技術，給未來生物工程及人類的個性化醫療衛生帶來深遠的影響。
關鍵詞：氮化硅；聚焦離子束；納米孔；阻塞電流
納米孔作為一種新型的納米探測器，是單分子檢測的一項重要技術，其低成本、高通量的特性成為DNA超快速測序實現的關鍵技術之一。1996年，Kasianowicz等人首次報道了α-溶血素（α-HL）蛋白質納米孔，并檢測出DNA和RNA分子過孔產生的阻塞電流。
此方法一經提出，就引起了廣泛的關注，也是生物膜上各種通道轉變為納米孔的開端。不過，由于生物納米孔脆弱、不穩定、孔徑無法隨意控制，限制了它的廣泛應用。隨著微加工技術的發展，固態納米孔應運而生。2001年，Li等人首次利用自制的離子束反饋控制系統在Si3N4薄膜上刻蝕出納米孔，用于DNA檢測。隨后，Dekker小組利用300kV的高能聚焦電子束（focusionbeam,FIB）在SiO2薄膜上刻蝕出納米孔。隨著研究的日趨升溫，更多制備固態納米孔的方法陸續出現，如應用聚焦電子束誘導刻蝕、低能電子束刻、激光束光刻、電化學腐蝕等方法，在氮化硅、氧化硅或其它金屬氧化物等薄膜介質上制備出穩定的納米孔。為了得到更小的孔，通過原子沉積、離子束沉積、高能電子束液化等進行縮孔的技術也得到發展，以滿足納米孔的應用。
同時，制備納米孔的材料也更加廣泛，從氧化硅等金屬氧化物，到塑料、玻璃、石墨烯等高分子化合物，都成為固態納米孔的加工材料。固態納米孔具有穩定性好，尺寸可控，表面特性可調等優勢，已成為目前單分子檢測領域的研究熱點。
不過，固態納米孔的制備工藝目前仍然比較復雜，成功率和穩定性有待提高，納米孔的形貌特征也直接影響著納米孔器件的靈敏度和可靠性。因此，發展一種簡單、可靠的納米孔制備工藝是目前納米孔器件發展的關鍵。本文以氮化硅絕緣材料為基底，采用微加工技術設計和制備了自支撐的氮化硅懸空膜結構，然后，利用聚焦離子束（FIB）刻蝕懸空膜。
通過優化聚焦離子束的系統參數，得到一系列孔徑和錐度可控的納米孔。制備好的納米孔置于膜片鉗檢測裝置中，顯示出良好的伏安特性。當加入DNA分子時，電流瞬時下降，得到一系列明顯、穩定的阻塞信號。這些結果表明，本文采用的固態納米孔的制備工藝是切實可行的，該方法制備的納米孔可以用于不同生物分子的檢測和分析，促進其在基因測序，生物傳感等領域的廣泛應用。材料和方法材料采用4寸晶圓、厚310μm、<100>型雙面拋光的單晶硅片為基片，先后通過低壓氣相沉積分別沉積500nmSiO2和100nmSi3N4薄膜。所用硫酸、過氧化氫、氫氟酸、氫氧化鉀、氟化銨、乙醇和丙酮等試劑均為分析純，所用溶液均為去離子超純水配置（Millipore,>18MΩ/cm）。Si3N4膜懸空結構的制備以4寸晶圓、厚310μm、<100>型雙面拋光單晶硅片為基底，通過濕氧化和低壓氣相沉積，分別沉積500nmSiO2和100nmSi3N4的薄膜，然后，腐蝕或刻蝕形成Si3N4膜懸空結構。
掩模版圖形的設計在腐蝕或刻蝕的過程中，利用傳統的光刻技術，先在基片上均勻地甩上一層抗蝕劑（也稱光刻膠），然后，通過掩模版在各種波長的光下曝光，將掩模版上的圖形轉移到光刻膠上。
各層膜的制備將基片清洗干凈后，通過濕氧化的方法在硅片雙面生長約500nm厚的SiO2層，作為過渡層。然后，用化學氣相沉積的方法將Si3N4膜沉積在雙面SiO2膜上。各層膜的腐蝕為了進一步得到Si3N4膜的懸空結構，需要去除掉部分Si和SiO2形成的Si3N4懸空結構。膜腐蝕加工過程如圖1所示。
（A）掩膜版圖形的轉移：在已沉積了膜的Si基片的一面，利用甩膠機均勻地甩上一層光刻膠（正膠），用紫外光進行曝光，使暴露在光下的光刻于FIB的納米孔制備本文采用FEI公司生產的聚焦離子束加工系統，型號為StrataFIB201,可利用離子束刻蝕出納米級或微米級的一維或二維結構，以及一定深度的三維結構，或者用離子束誘導化學氣相沉積方法沉積納米及微米級的金屬與介電質結構材料。儀器所使用的軟件為FEI'sxP2.25,采用Ga69液態金屬離子源，加速電壓為5~30kV;離子束流強度為1~11500pA（分10檔）；離子束成像分辨率為7nm（1pA、30kv）；樣品臺直徑為50mm;離子束通道的真空度保持在10-4Pa,采用spot打孔模式。實驗樣品為自制的氮化硅懸空薄膜，通過設定不同的FIB作用時間，制備不同孔徑的納米孔，然后通過掃描電鏡（scanningelectronmicroscope,SEM）成像系統對納米孔進行表征和分析。
當施加電壓后，電場分布在納米孔及其附近。電流信號通過16位的DAQ數字卡采集，采樣頻率為10kHz.為了去除電磁噪音，整個流體裝置放入Faraday屏蔽箱。DNA分子加入負極的室內后，在電場驅動下，從負極向正極運動，進入納米孔的捕獲區。DNA過同一納米孔的信號經過多次實驗重復，過孔事件通過Labview記錄并用Matlab軟件分析。
結果和討論
SEM表征納米孔FIB是一種極具潛力的納米加工工具，可用于離子束曝光、刻蝕、輔助沉積或注入摻雜等。
本文采用FIB在氮化硅懸空薄膜上打孔，通過設定不同的打孔時間，制備得到十幾到幾百納米的孔。如圖3顯示，當FIB作用時間為15、10、5、3和1s時，分別得到孔徑為41.60、37.94、32.68、26.9和16.67nm的納米孔。作用時間太短時，如0.3s,薄膜未能被擊穿。通過大量的實驗，我們發現當保持離子加速電壓和離子束電流不變，隨著FIB作用時間的增加，制備的納米孔的孔徑會不斷增大。但孔徑的增大和作用時間不是簡單的線性關系。隨著作用時間的增加，孔徑增加的速度逐漸減小。當時間足夠長時，孔徑并不會無限地增大，而是趨于一個穩定的值。通過對不同厚度的氮化硅薄膜打孔分析，我們發現這一規律同樣適用。當離子束電壓、離子束電流、離子束通道真空度為定值時，孔徑的大小變化與作用時間有關，與薄膜的厚度無關。
通過SEM電鏡測得的錐形孔的孔口和孔底直徑，以及薄膜厚度，我們得到了納米孔的錐度角。如圖4所示，在設定的打孔條件下，隨著離子束作用時間的增長，雖然孔徑在增大，但納米孔的錐度角卻越來越小，最終趨近于72°角。這和離子束的能量及入射角等因素是相關的。聚焦離子束中鎵離子束的能量分布并不是一個嚴格的點，而是呈高斯分布，離子束中央部分能量較高，然后，逐漸向邊緣遞減。此外，打孔時，離子束聚焦的位置和離子束的束徑也會影響到納米孔的形貌。
當在納米孔兩側施加一系列不同強度的正、負電場時，電解質溶液通過納米孔作定向運動，得到不同的離子電流。圖5A為溫度為25℃時，不同孔徑的納米孔在1mol/L的KCl溶液條件下得到的伏安特性曲線，可見孔徑增大，得到的離子電流也增大。
納米孔具有一定的整流效應，這主要是由于納米孔有限的空間使得通過的離子同孔壁表面的電荷發生相互作用，產生了離子優先選擇性。當然，離子電流的整流特性不僅與納米孔的形狀有關，而且還與溶液成分、溶液濃度和pH值等因素有關。
另外，我們對納米孔的電信號進行了理論預測，發現當納米孔處于電解質溶液中時，薄膜兩側的電極所測得的響應電流和檢測系統的電阻有關，主要包括溶液的電阻及納米孔本身的電阻。根據Hall對柱形納米孔的電阻理論，我們對錐形納米孔的電阻進行了估算。
從圖中可以看出，單位時間內DNA過孔的通量比較高，可達到檢測的目的。阻塞信號主要通過阻塞電流（currentblockage）和易位時間（transitiontime）來表征。阻塞電流是DNA分子在納米孔中由于體積阻塞效應引起的電流的急劇下降；易位時間是DNA分子穿過納米孔的時間，主要包括在孔口捕獲區與孔相互作用進入納米孔及在納米孔內運動的時間。通過對大量過孔事件的統計，得到了如圖6B和C所示的阻塞信號的分布直方圖。從圖中可以看出，阻塞電流和易位時間分別呈高斯分布和泊松分布。
當電壓為400mV時，阻塞電流為170pA,易位時間分布在1~10ms.易位時間比DNA通過更小孔（如10nm和~200-800μs）的時間要長，這可能是因為DNA與納米孔之間的相互作用引起的。隨著驅動電壓的增大，阻塞電流逐漸增大，同時過孔速度加快，易位時間減少?？紤]到目前DNA過納米孔測序的主要問題之一就是過孔速度過快，直接影響到過孔信號的采集。因此，我們在增大電壓、提高DNA過孔的通量和阻塞電流強度的同時，也要考慮到DNA分子過孔的速度?？偨Y本文利用聚焦離子束在氮化硅薄膜上刻蝕納米孔，發現通過改變打孔時間等聚焦離子束的系統參數，可以制備出孔徑和錐度可控的納米孔，以滿足不同生物分子檢測的需求。
該方法簡單、可靠，制備的成功率比較高。通過SEM和電學信號顯示，該納米孔具有很好的表面特性和伏安特性。同時，我們利用制備的納米孔對DNA分子進行實驗，得到了較高的過孔通量和阻塞信號，進一步證明了基于FIB的氮化硅納米孔加工工藝的可靠性。隨著固態納米孔制備工藝的不斷完善，納米孔有望發展成為一種方便、快速、廉價的單分子檢測技術，給未來生物工程及人類的個性化醫療衛生帶來深遠的影響。
