左旋天門冬酰胺酶（L-asparaginase，L-ASNase）是治療淋巴細胞白血病等惡性血液病的重要藥物之一。某些類型的腫瘤細胞表達的L-天門冬酰胺合成酶（L-asparagines synthetase，L-AS）活性遠遠低于正常細胞，難以在胞內將氨或 L-Glu 的酰胺基在ATP和Mg2+存在時有效地轉移至L-Asp的β羧基生成L-Asn，因而迫使這類腫瘤細胞利用外源Asn以維持胞內蛋白質合成與細胞增殖；而L-ASNase可水解Asn（必需氨基酸）為Asp和氨，由于人體內不存在天然L-ASNase，若向患者體內引入L-ASNase，全身性降解Asn，可使這類腫瘤細胞因L-AS活性低，不能獨立合成Asn，造成Asn饑餓，導致蛋白質的生物合成紊亂而死亡，達到在不影響正常細胞生理功能的前提下殺傷腫瘤細胞的目的。但L-ASNase是異源酶，免疫原性易致人體產生滅活酶的抗體，且不良反應較大，因此亟待研發低免疫原性L-ASNase給藥方案。目前有臨床試驗將L-ASNase用急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）復發患者的自體紅細胞（red blood cell，RBC）封裝后再自體回輸，該給藥方案在理論上可消弱L-ASNase的抗原性，阻礙治療性酶被宿主蛋白水解酶降解；在臨床上也觀察到可降低ALL復發患者抗-L-ASNase抗體的形成，明顯減弱過敏反應、凝血功能障礙和肝功能失常，改善了病患的健康狀況。然而，這種用非基因修飾方法將藥物封裝進RBC的方案或多或少均改變了RBC的形態和細胞膜特征（如易碎、變形性下降等），增加了機體清除這部分RBC的機率。

由于造血干細胞在體外向紅細胞定向分化需時較長，若向造血干細胞中引入L-ASNase基因，可以使其在定向分化過程中開始表達L-ASNase，克服紅細胞生命力短暫、難以在體外長期存活之弱點，延長藥物時效，為尋找合適的分化期導入體內遏制ALL奠定基礎。

在本研究中，我們用攜帶L-ASNase的紅細胞特異性重組慢病毒載體系統包裝出自滅活（self-inactivation，SIN）重組慢病毒，以小鼠紅白血?。╩urineerythroleukemia，MEL）細胞經誘導可向紅細胞終端分化為模型，探討重組慢病毒感染后MEL細胞在分化過程中表達L-ASNase目的基因，延長藥物時效的可行性。

1、 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎（human embryonic kidney，HEK）293T細胞、MEL細胞、小鼠成纖維細胞NIH/3T3和穩定表達對照病毒RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3細胞、人宮頸癌 HeLa 細胞為本課題組保存；大腸桿菌DH5α、包裝質粒psPAX2、包膜蛋白質粒pMD2.G、轉移質粒 RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）、RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry和RRL-sEF1α-2A-mCherry為本課題組保存。

各種限制性內切酶為 New England Biolabs 公司產品；DMEM培養基、AIM-V XIVIVO-5培養基、胎牛血清（FBS）為Invitrogen Gibco公司產品，O6-芐基鳥嘌呤（O6-benzylguanine，BG）、雙氯乙亞硝脲［1，3-bis（2-chloroethyl）-1-nitrosourea，BCNU；商品名為卡莫司?。?、六亞甲基二乙酰胺（N，N'-hexamethylene bisacetamide，HMBA）、聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）和聚凝胺（polybrene）為 Sigma 公司產品；兔抗大腸桿菌L-ASNase多抗為GeneTex公司產品；小鼠抗 mCherry 單克隆抗體為 EarthOx 公司產品；青霉素和鏈霉素溶液（以下簡稱雙抗）為Hyclone公司產品；InstaGene Matrix為Bio-Rad公司產品；熒光定量（TaqMan）快速 PCR 混合試劑盒（2×）為 ABI公司產品；哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑（mammalian protein extraction reagent，M-PER）、2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒為Pierce公司產品；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG和鍵合了 Alexa 488的山羊抗兔IgG為Affinity Biologicals公司產品；標準品L-ASNase為日本協和發酵麒麟株式會社產品。

1.2 慢病毒轉移載體的設計和制備

RS9- L- ASNase- 2A- mCherry- PGK- MGMT-HS4-IVS2（-）的結構（圖1）中，為方便監測目的基因的表達，將編碼L-ASNase的cDNA通過2A聯接體技術與編碼紅色單體熒光蛋白mCherry的cDNA連接，同受β-珠蛋白啟動子（promoter，P）、β-珠蛋白3'端增強子（enhancer，E）和β-珠蛋白位點控制區（locuscontrol regions，LCR）DNaseⅠ高敏位點（hypersensitive site，HS）中具有較強增強子活性的HS2和具有染色質開放活性的HS3調控。2A為源于一點褐翅蛾病毒的2A短肽（Thosea asigna virus 2A，T2A），當核糖體快速處理2A肽C端甘氨酰-脯氨酰之間的肽鍵合成時，會引起 2A 肽與其下游肽之間發生自裂解，該序列允許在同一讀框中通過2A的自裂解表達多種非融合的獨立的目的蛋白。位于載體3'端可以非組織特異性地表達甲基鳥嘌呤甲基轉移酶變異體（methylguanine methyltransferase，MGMT）P140K的耐藥基因由人磷酸甘油酸激酶啟動子（phosphoglycerate kinase promoter，PGK-P）控制，這樣可以通過使用化療藥物BG和BCNU富集基因修飾的陽性細胞，并確保在篩選富集細胞的過程中目的基因受到有效控制，不會表達。為提高載體制備的有效性，增加慢病毒滴度和轉染率，刪除了慢病毒載體LCR 區域中功能待定的 HS1 和有增強子活性的HS4，同時刪除了β-珠蛋白中具內含子增強子活性的第 2 個內含子（intervening sequence 2，IVS2）。

由于LCR主要的功能是激活β-珠蛋白基因簇，限制珠蛋白基因僅在紅系細胞中表達，確保受調控基因在發育或分化過程中以一定的時序和模式正確表達，因而賦予該載體具有紅系組織特異性。

為快速測定慢病毒載體所攜帶的目的基因可否在靶細胞中表達，我們還構建了非組織特異性慢病毒載體 RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry，利用2A聯體技術將L-ASNase基因和mCherry報告基因置于短的延長因子 1α（short elongation factor 1α，sEF1α；刪除了第一內含子）啟動子控制下，在聯體基因的3'端增加了土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element），以提升 mRNA 的 polyA 加尾效率。

為驗證2A是否影響下游報告基因的正常表達，還構建了僅表達2A-mCherry的非組織特異性慢病毒載體RRL-sEF1α-2A-mCherry。應用不同的限制性內切酶及DNA重組技術構建上述慢病毒轉移載體。

1.3 重組慢病毒包裝

用三質粒系統瞬時轉染HEK 293T細胞制備重組慢病毒顆粒。當 HEK 293T細胞在 10 cm細胞培養皿中生長達80%~90%匯合時，棄含雙抗（青霉素終濃度為 50 U/mL，鏈霉素終濃度為 50 mg/mL）的完全DMEM培養基（含10% FBS），將PEI轉染三質?；鞈乙海ㄙ|?？偭繛? μg/皿，pMD2.G、psPAX2和轉移質粒按1∶2∶3的質量比例混懸于1 mL無血清無抗生素 DMEM 中，再加 24 μL pH7.0 的 1 μg/μL PEI）加至用9 mL含10% FBS的完全培養基覆蓋的HEK 293T細胞中，24 h后棄上清，換預熱的新鮮完全培養基，分別于48和96 h收獲細胞培養上清中的病毒液，500 r/min離心10 min除去脫落的細胞和大的細胞碎片，用0.45 μm的濾器過濾上清，濾液經8500 r/min離心12 h濃縮病毒顆粒，用無血清的AIM-V XIVIVO-5培養基重懸病毒顆粒，分裝至凍存管，-80℃保存備用。將重組慢病毒以載體名稱命名。

1.4 重組慢病毒滴度測定

用終質量濃度為 8 μg/mL 的 Polybrene 介導重組病毒顆粒轉染小鼠成纖維細胞NIH/3T3，培養7 d后用InstaGene Matrix抽提基因組DNA。以穩定表達對照病毒RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3細胞基因組為對照，2 套引物-探針聯合使用，采用多重TaqMan PCR 檢測病毒滴度。慢病毒序列檢測所用正向引物為 GAG-F（5'-GGAGCTAGAACGATTCGCAGTTA-3'），反向引物為 GAG-R（5'-GGTTGTAGCTGTCCCAGTATTTGTC-3'），探針為 GAG-P（5'-［FAM］ACAGCCTTCTGATGTTTCTAACAGGCCAGG［TAMRA］-3'）。小鼠β-actin（簡稱 BAC）為內源性對照，正向引物為 BAC-F（5'-GGCACCACACCTTCTACAATG-3'），反向引物為 BAC-R（5'-GGGGTGTTGAAGGTCTAAAC-3'），探針為 BAC-P（5'-［HEX］TGTGGCCCCTGAGGAGCACCC［BHQ1］- 3'）。 用Applied Biosystems 公司的 7500 PCR 儀，每個定量PCR 反應中基因組 DNA 共使用 100 ng（1×TaqMan快速PCR混合試劑，500 nmol/L基因特異性正、反向引物和探針），每組反應設3個重復。在SDS 2.1軟件中設置定量 PCR 反應程序為 95℃ 10 min 熱啟動；PCR反應94℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環。

已知穩定表達對照病毒 RRL-sEF1α-GFPLuc的 NIH/3T3 每個細胞中有 1 個慢病毒載體拷貝數（vector copy number，VCN），其基因組 DNA 用未感染慢病毒的NIH/3T3細胞基因組DNA進行1/5系列稀釋后，通過定量PCR獲得慢病毒轉染的VCN回歸曲線。根據該曲線，計算未知樣品中感染重組慢病毒 GAG 基因的拷貝數。病毒滴度（titer，T）計算公式：T（U/mL）=VCN×稀釋率的倒數×起始細胞數。

1.5 免疫染色

人宮頸癌 HeLa細胞接種于 6孔培養板的無菌蓋玻片上，非組織特異性重組慢病毒RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry 按 1∶10 稀釋感染 HeLa 細胞，24 h 后換新鮮完全培養基，96 h 后用 PBS 洗 3次，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗后用含0.5%Triton X-100的PBS透化30 min，用Image-iT FX信號增強劑封閉30 min，加入1∶500稀釋的兔抗大腸桿菌L-ASNase多抗室溫孵育2 h，PBS洗后，加入1∶1000稀釋的鍵合了Alexa 488的山羊抗兔IgG，室溫避光孵育60 min，PBS洗后，晾干的蓋玻片用抗褪色金牌介質在載玻片上裝片，指甲油封片。

1.6 BG/BCNU篩選與報告基因檢測

為有效富集陽性轉染細胞，MEL細胞經重組慢病毒感染后，先與 50 μmol/L BG孵育 1 h，再加 50μmol/L BCNU于37℃共孵育1 h，1 h后換預熱的不含藥物的新鮮培養基，以后每3 d換1次培養液，移除懸浮細胞，篩選14 d后進行后續實驗。分別在指定時間收獲1×105經篩選富集的感染非組織特異性重組慢病毒的MEL細胞，用流式細胞儀檢測mCherry紅色熒光強度，以評估BCNU有效篩選情況。用熒光顯微鏡監測感染組織特異性重組慢病毒的 MEL 細胞分別在 5 mmol/L HMBA 誘導前、后報告基因 mCherry的表達情況，以評估調控因子對目的基因組織特異性表達的控制效果。

同時用流式細胞儀監測感染或未感染重組慢病毒的 MEL 細胞經 5 mmol/L HMBA 誘導前、后報告基因mCherry的表達情況，以評估MEL細胞向紅系終端分化過程中攜帶目的蛋白的能力。

1.7 免疫印跡

在指定時間收獲感染或未感染或誘導的 MEL細胞，用哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑抽提細胞總蛋白，用 Bradford 法進行蛋白定量，取等量總蛋白（每孔 60 μg/20 μL）進行 12% SDS-PAGE，然后轉移至PVDF膜，室溫下用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，膜與1∶1000稀釋的一抗于4℃孵育過夜，洗膜后與HRP標記的二抗于37℃溫育1 h，ECL顯色，獲取圖像。檢測L-ASNase印跡膜使用的一抗為兔抗大腸桿菌L-ASNase多克隆抗體，二抗為山羊抗兔IgG；檢測 mCherry的印跡膜使用的一抗為鼠抗 mCherry單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG；檢測看家基因GAPDH表達的印跡膜使用的一抗為鼠抗GAPDH單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG。

2、 結果

2.1 慢病毒轉移載體的構建和鑒定

為增加慢病毒滴度和轉染率，在不影響重組蛋白表達的組織特異性和預期可以維持目的基因需要的表達水平的基礎上，采用優化的基因調控因子，即選擇較短的β-珠蛋白啟動子，并去除β-珠蛋白IVS2和LCR中的HS1和HS4，構建了結構正確的含目的基因及報告基因的紅細胞組織特異性的慢病毒載體RS9- L- ASNase- 2A- mCherry- PGK- MGMT- HS4-IVS2（-）、非組織特異性慢病毒載體RRL-sEF1α-L-ASNase- 2A- mCherry 和 RRL- sEF1α- 2A- mCherry（圖1），并經限制性酶譜鑒定和測序分析驗證。

2.2 重組慢病毒滴度檢測

重組慢病毒載體分別與包裝質粒psPAX2和包膜蛋白質粒pMD2.G經PEI介導瞬時共轉染293T細胞獲得重組慢病毒，經8500 r/min離心濃縮，用多重TaqMan PCR 測得重組慢病毒 RS9-L-ASNase-2A-mCherry- PGK- MGMT- HS4- IVS2（-）的 滴 度 為（4.21±0.58）×107U/mL，RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry的滴度為（7.6±2.5）×106U/mL，RRL-sEF1α-2A-mCherry的滴度為（2.05±0.67）×107U/mL。

2.3 重組慢病毒RRL- sEF1α- L- ASNase- 2A-mCherry在HeLa細胞中表達攜帶基因的檢測

為快速鑒定采用2A聯體技術可實現重組慢病毒在感染細胞中同時表達目的基因及報告基因，將非組織特異性重組慢病毒RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry按1∶10稀釋后感染HeLa細胞。在激發光為587 nm、發射譜為610 nm的熒光顯微鏡下檢測到 mCherry 報告基因主要在感染細胞核中表達（紅色熒光）（圖2B），L-ASNase基因主要在細胞質內表達，L-ASNase可與多抗結合，用鍵合了Alex 488的二抗可顯示綠色熒光（圖2C），提示mCherry與L-ASNase表達時自2A處自裂解，各自獨立成像，無共定位（圖2D）。

2.4 重組慢病毒感染MEL細胞后報告基因表達水平的測定

MEL細胞以MOI=10分別感染各包裝濃縮的重組慢病毒，用流式細胞儀在指定時間點監測化療藥物BG/BCNU對重組慢病毒感染MEL細胞的選擇富集效果（圖 3），對照為未感染慢病毒的 MEL 細胞。非組織特異性重組慢病毒感染MEL細胞中mCherry報告基因表達的陽性率經篩選后均有所提升，陽性細胞得到有效富集；組織特異性重組慢病毒感染MEL細胞中mCherry報告基因未表達。提示紅系特異性調控因子對基因表達控制較嚴格。多重 Taq

Man PCR檢測結果表明，用 BG/BCNU 篩選 16 d誘導0 d的MEL細胞中，組織特異性病毒的滴度是未經BG/BCNU篩選培養細胞的3.2倍（P=0.0025）。紅細胞特異性重組慢病毒感染的MEL細胞，經BG/BCNU 富集 16 d 后，用 5 mmol/L HMBA 誘導，MEL細胞在向紅系終端分化的過程中，在激發光為587 nm、發射光為 610 nm的熒光顯微鏡下檢測到mCherry報告基因在感染細胞中得到逐步增高的表達（紅色熒光）（圖4）。

用流式細胞儀對誘導的MEL細胞進行監測，結果如圖5，紅細胞組織特異性重組慢病毒表達報告基因 mCherry 的細胞數量隨誘導時間的延長而增多，非組織特異性的則相反。對照為未感染重組慢病毒，但用HMBA誘導同樣時間的MEL細胞。

2.5 重組慢病毒攜帶目的基因及報告基因的表達鑒定

Western 印跡分析顯示 ，重組慢病毒RRL-sEF1α-2A-mCherry感染的 MEL細胞裂解物中，2A肽N端的部分序列通過自裂解作用游離出來，2A肽C端的部分序列與紅色單體熒光蛋白 mCherry的 N端結合；而重組慢病毒 RS9-L-ASNase-2A-mCher
ry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）感染的 MEL 細胞經BG/BCNU選擇和HMBA誘導7 d后，細胞內表達的L-ASNase的C端結合了2A肽自裂解作用產生的N端部分序列（圖6）。

3、 討論

在抗癌研究過程中，人們發現多種代謝異常的惡性腫瘤依賴某些外源性氨基酸，例如兒童ALL、卵巢癌、成人非霍奇金淋巴瘤不能合成L-Asn，需要從血液中吸收Asn供其生長，因而耗竭腫瘤必需氨基酸而對正常細胞不良反應最小的癌細胞選擇性療法誕生了。利用L-ASNase靶向性酶解L-Asn在治療兒童ALL中取得了顯著成功，患兒5年生存率已提高到 80％以上，也能明顯減小非霍奇金淋巴瘤。

然而，由于人體內不存在天然L-ASNase，而異源L-ASNase在臨床應用中受限的主要原因是其免疫原性，以及由此引發的過敏反應、過敏性休克及酶的免疫抑制與清除。因此，降低異源酶的免疫原性，突破臨床應用的局限性，成為研究人員需要解決的主要問題。

目前供臨床使用的細菌源天門冬酰胺酶制劑有3種類型，一種是大腸桿菌-天門冬酰胺酶（E.coli-asparaginase，EcA），第二種是聚乙二醇-天門冬酰胺 酶（polyethylene glycol- asparaginase，PEGA）。EcA或PEGA是治療ALL的一線方案。第3種歐文菌-天門冬酰胺酶（Erwinia-asparaginase，ErA）與EcA具有不同的免疫學特性，在歐洲和美國用作過敏患者的二線或三線治療方案。

由于 RBC的壽命和大小明顯超過其他藥物遞送載體，近年來已有50多種抗感染藥物、抗炎癥藥物、抗腫瘤藥物、解毒作用的酶甚至遺傳物質，或采取藥物誘導的細胞內吞作用、電穿孔、蛋白質轉導結構域（protein transduction domain，PTD）和低滲透壓的方法把藥物在體外封裝到RBC內，或通過生物素-親和素結合的方法把藥物與RBC表面偶聯的方式進入了臨床研究【圖5、6】。近年來，采用基因修飾的方法使攜帶目的基因的造血干細胞（hematopoieticstem cell，HSC）在向終端分化成為紅細胞的過程中表達而發揮治療作用的方案，已在B型血友病研究中展開。我們擬借鑒此系統，利用基因修飾后表達L-ASNase的紅細胞開展惡性血液病的治療研究。

熒光顯微觀察結果提示，通過2A聯體技術連接的L-ASNase和mCherry在細胞的不同區域表達，即mCherry不會干擾L-ASNase行使功能。流式細胞術和多重 TaqMan PCR 法結果顯示，用 50 μmol/LBG-50 μmol/L BCNU可以有效富集重組慢病毒感染的陽性細胞。由于血紅蛋白是由α-珠蛋白、β-珠蛋白和血紅素組成的結合蛋白，紅細胞組織特異性慢病毒載體使用的是β-珠蛋白基因調控序列，可以預計當感染該重組慢病毒的MEL細胞經誘導向紅系終端分化的過程中，隨著血紅蛋白表達的增高，紅細胞組織特異性重組慢病毒攜帶的目的基因及報告基因的表達也將增高。非組織特異性慢病毒載體使用的是非組織特異性的sEF1α啟動子，可以預計當感染該重組慢病毒的MEL細胞向紅系終端分化過程中，目的基因的表達會隨著血紅蛋白表達的增加而逐漸受到抑制。結果顯示，分別用紅細胞組織特異性重組慢病毒 RS9- L- ASNase- 2A- mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）、非組織特異性重組慢病毒 RRL- sEF1α- L- ASNase- 2A- mCherry 和 RRL-sEF1α-2A-mCherry感染MEL細胞，經化療藥物BG/BCNU選擇和 HMBA誘導紅細胞分化后，紅細胞組織特異性重組慢病毒表達報告基因mCherry的陽性MEL細胞百分率隨誘導時間的延長而增多，非組織特異性的則相反，與預計吻合。提示本研究建立的紅細胞組織特異性重組慢病毒更適合于基因修飾紅細胞開展惡性血液病的治療。Western印跡結果顯示L-ASNase和mCherry表達時在2A處發生了自裂解，所得表達產物與預計相符；與梯度稀釋的標準品L-ASNase的灰度值相比較，在60 μg/孔總蛋白上樣量中，計算出 L-ASNase 量為 0.0179 U，即約為 0.3U/mg總蛋白。參考非基因修飾方法將L-ASNase封裝進 RBC，給荷 L5178Y 淋巴瘤動物模型一次輸注8 U，本項目預計需要制備大量攜帶 L-ASNase 的基因修飾紅細胞才可能達到體內治療效應。盡管MEL細胞模型比較經濟，然而MEL細胞可使小鼠發生類似于紅白血病的病征，輸注由其衍生的紅細胞風險較大，因此仍須選擇造血干細胞進行基因修飾，我們還將繼續探索。