0、引言
近年來,酸乳制品因其具有保健、長壽、美容以及醫藥應用的效果而倍受消費者青睞,市場前景十分廣闊.保加利亞乳桿菌 \\(Lactobacillus bul-garicus\\)是用于酸乳發酵的主要菌種之一,其通過發酵鮮奶產酸、產胞外多糖以及風味物質,賦予酸奶獨特的風味、良好的質地和細膩的口感.
同時,其具有調節人體胃腸道微生態平衡、促進消化吸收、增強免疫功能、抗癌抗腫瘤等重要的生理保健功能,因而受到更多人的關注.在酸乳生產中,開發高活性、低成本酸奶直投式發酵劑備受國內外學者關注,而該工作首先必須獲得能夠使乳酸菌快速生長的增菌培養基.
乳酸菌增菌培養基的研究國內外具有不同的方法.
如程艷宇等人,通過優化MRS培養基中Mg,Mn和Fe 3種微量元素的配比,實現了保加利亞乳桿菌的增殖.劉海燕、呂加平等人使用番茄汁、胡蘿卜汁、啤酒等物質對植物乳桿菌等乳酸菌進行了增殖研究,并取得了一定成果.
安莉等人以17種氨基酸與牛乳的復合物為主要材料,研究了氨基酸對保加利亞乳桿菌生長的影響,證明絲氨酸、賴氨酸、亮氨酸與牛乳復合時對保加利亞乳桿菌促生長作用明顯.Claire L.V.、周景欣等人經過體外試驗、臨床研究發現,低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖等對人體腸內乳酸桿菌均有明顯的增殖作用.
另有研究者利用保加利亞乳桿菌發酵不同蔬菜來研究蔬菜對其增殖的影響,取得了一定的成果.本課題組前期從牛乳發酵劑中篩選獲得了能顯著降低羊乳膻味和改善羊乳質地的發酵菌株,并對其凝固羊乳發酵條件進行了優化,通過添加嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌等適宜菌株研究了羊乳發酵的條件.
本文采用保加利亞乳桿菌\\(LB\\)為試驗菌株,以基礎培養基為基礎,通過PB實驗設計方法,對7種碳源/益生元和8種氨基酸進行了篩選,以期獲得影響LB增菌的碳源/益生元和氨基酸,為進一步優化保加利亞乳桿菌增菌培養基和制備直投式酸羊奶凍干發酵劑提供技術支撐.
1、材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種及培養基
保加利亞乳桿菌 \\(Lactobacillus bulgaricus,LB\\),由本實驗室前期分離篩選,適宜用于羊奶發酵.MRS培養基:青島高科園海博生物技術有限公司,液體培養基用于LB的活化,瓊脂培養基用于其計數.LB發酵基礎培養基:葡萄糖5.43g,蛋白胨0.98g,磷酸氫二鉀0.59g,蒸餾水100mL,pH值6.4~6.6.118 ℃滅菌15min.用于LB的基礎培養.
1.1.2主要試劑及儀器
實驗中各種糖類、氨基酸以及上述培養基中所用試劑均為生化試劑級.DH5000AB型電熱恒溫培養箱:天津市泰斯特儀器有限公司;SW-CJ-1F無菌操作臺:蘇州凈化設備有限公司;DH5000AB電手提式蒸汽壓力滅菌器:江陰濱江醫療器械廠;722型光柵分光光度計:上海第三分析儀器廠;PB-10酸度計:賽多利斯\\(北京\\)科技有限公司.
1.2方法
1.2.1菌種活化及培養
MRS培養基經118 ℃滅菌15min,放于冰箱備用.取保加利亞乳桿菌\\(LB\\)的凍干菌粉,在無菌條件下,以2%的接種量接種于MRS培養基中,37℃下恒溫培養24h.鏡檢確定無雜菌,再重復轉接3次至活力穩定,即可達到活化目的.
1.2.2保加利亞乳桿菌培養基優化本實驗采用
PB設計進行分類篩選,以LB發酵基礎培養基為培養基,優化碳源\\(乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、水蘇糖及菊糖7種\\)、氨基酸\\(羥脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及谷氨酸8種\\).以上實驗接種量均為3%,35℃培養20h后,測定其pH、OD值及活菌數.每組做3個平行,以活菌數為響應值,確定最優的碳源及氨基酸.
1.2.3菌體濃度測定
\\(1\\)活菌計數法:采用固體MRS培養基,梯度稀釋平板計數法分別對LB進行計數.
\\(2\\)分光光度法:取增菌培養液,以未接種的空白培養基為對照,采用可見光分光光度計,在波長600nm下比色而得.
1.2.4培養液pH值的測定
采用PB-10酸度計,室溫下直接測定發酵液pH值,每份3個平行.
1.2.5碳源/益生元影響因子的篩選
選取N=12的PB設計,以葡萄糖\\(X1\\),乳糖\\(X2\\),低聚木糖\\(X3\\),低聚果糖\\(X4\\),低聚半乳糖\\(X5\\),低聚異麥芽糖 \\(X6\\),水蘇糖 \\(X7\\),菊糖\\(X8\\)8個因素為考察對象,并以活菌數\\(Y\\)為響應值,各因素分別取高\\(+\\)、低\\(-\\)兩個水平,低水平設置為原始的培養條件,高水平是低水平的2倍,12次試驗中,菌體均在35 ℃下培養20h后,測定其pH、OD及活菌數,每組設3個平行.各個因素的編碼水平見表1所示.
1.2.6氨基酸影響因子的篩選
菌體的生長除了碳源外,還需要氨基酸、維生素等物質,它們能對菌體的生長起到一定的促進作用.采用9因素兩水平、N =12的實驗設計,對羥脯氨酸\\(X1\\)、精氨酸\\(X2\\)、亮氨酸\\(X3\\)、絲氨酸\\(X4\\)、天冬氨酸\\(X5\\)、酪氨酸\\(X6\\)、谷氨酸\\(X8\\)、苯丙氨酸\\(X9\\)等進行研究.其中\\(X7\\)是虛擬項,以減少誤差.活菌數\\(Y\\)為響應值,篩選出影響較大的因素.35℃下培養20h后,測定其活菌數及pH,每組設3個平行.各個因素的編碼水平見表2所示.
2、結果與討論
2.1碳源/益生元影響因子篩選結果分析
試驗設計及結果見表3所示.OD和pH作為參考值,活菌數為響應值.
所示.
結果顯示,各個因素對LB生長的影響強弱為:X1> X8> X4> X6> X2> X5> X7>X3.其中X1\\(p=0.033\\)是影響LB生長的顯著因素,X4\\(p=0.091\\)、X8\\(p=0.061\\)均為重要因素.X1、X4、X8對LB生長影響均呈正效應\\(如圖1所示\\).
上述結果中菊糖、低聚果糖對LB的增菌影響與周景欣、呂利軍等人的研究結果相似,均對乳桿菌具有增菌作用;葡萄糖、乳糖的增菌作用與史媛英的研究結果有差異,本實驗中葡萄糖的影響更加顯著,乳糖的作用較小且呈負效應\\(T=-1.265\\),這種差異可能是菌種不同所導致.
2.2氨基酸影響因子篩選結果分析
試驗設計和結果見表5所示,分析時以活菌數為響應值.
根據SAS軟件分析得到圖2,由圖2可知,剔除X7虛擬項后的八個因素,其中前三個因素即谷氨酸\\(X8\\)、羥脯氨酸\\(X1\\)和酪氨酸\\(X6\\),條帶較長,即對LB生長的影響較大.且X1、X6對響應值Y呈正效應,而影響最大的X8則呈負效應\\(T=-1.005\\),如圖3所示.上述結果與安莉等人的研究結果不同,在本實驗中絲氨酸、賴氨酸的影響相對于谷氨酸、羥脯氨酸和酪氨酸較小,且亮氨酸呈負效應.
3、結論
采用PB實驗設計,從7種碳源/益生元和8種氨基酸中分別篩選出顯著影響保加利亞乳桿菌增殖的因子.
結果表明,葡萄糖、低聚果糖、菊糖、酪氨酸和羥脯氨酸等有利于保加利亞乳桿菌的生長,概率水平>90%,且對菌體的累積呈正效應,其中影響最顯著的碳源為葡萄糖\\(p=0.033\\),概率水平>95%;谷氨酸的添加對保加利亞乳桿菌的生長有顯著的抑制作用,在直投式酸羊乳凍干發酵劑制備中其添加量受到限制.
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