腺苷\\( Adenosine\\) 化學名為 6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氫嘌呤，在醫藥和食品領域有廣泛的應用。早在 20 世紀 50 年代，應用微生物發酵法生產腺苷的研究就已經開始，但是對腺苷研究的報道主要集中在菌種的選育和培養基的優化，使用基因工程技術改造腺苷生產菌的研究卻很少。本實驗室保藏的腺苷生產菌 Bacillus subtilisXGL，是通過長期誘變篩選而成，但是進一步誘變對產苷影響不大，要獲得更加優良的菌株，需要利用新的方法對其進一步改造。
前期研究顯示，對嘌呤合成途徑改造，改變途徑中關鍵酶的活性進而影響嘌呤合成速率，可以有效地提高肌苷、核黃素的產量。因此，嘌呤合成途徑的強弱直接影響核苷類物質的合成。嘌呤合成途徑的重要中間代謝物肌苷酸\\( IMP\\) 是腺苷合成的直接前體物，肌苷酸的供應很可能是工程菌中腺苷合成通量的主要限制因素之一。因此，增加葡萄糖到IMP 的合成途徑通量能夠提高腺苷合成中前體物的供應，繼而促進腺苷的積累。
在枯草芽孢桿菌中，嘌呤核苷酸合成相關的基因組成嘌呤操縱子，嘌呤操縱子\\( purEKB-purC\\( ORF\\) QLF-purMNH\\( J\\) -purD\\) 全長 13339 bp，由于嘌呤操縱子整體較大，而嘌呤合成途徑中關鍵酶PRPP 轉酰胺酶編碼基因 purF 位于嘌呤操縱子的中下游，距離啟動子較遠，轉錄效率不高。因此本研究以 B． subtilis XGL 為出發菌株，以溫敏質粒 pKS1 為骨架，構建整合質粒 pKF，利用單交換的方式將強啟動子 P43 插入至嘌呤操縱子中，不僅過表達了嘌呤合成途徑中關鍵酶 PRPP 轉酰胺酶編碼基因 purF，而且其下游基因 purM、purN、purH 和 purD 表達水平也得到不同程度的提高。這些相關基因的共同表達將比單一增強表達 purF 基因催化更多的嘌呤前體物谷氨酰胺、甘氨酸、10-甲醛四氫葉酸進入嘌呤途徑，將更加有效地提高嘌呤合成途徑通量。
1、 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和質粒: 表 1 為本研究所用菌株和質粒。
1. 1. 2 引物: 表 2 為本研究使用的引物，均由Primer Premier 5. 0 軟件設計。
1. 1. 3 培養基:①種子培養基\\( g/L\\) : 葡萄糖 20，酵母粉 5，味精 5，蛋白胨 8，尿素 5，黃嘌呤 0. 03，L-組氨酸 0. 03，MgSO4·7H2O 0. 4，KH2PO41，玉米漿 25mL，豆餅水解液 10 mL，pH 7. 0。②搖瓶發酵培養基\\( g/L\\) : 葡萄糖 80，味精 10，黃嘌呤 0. 03，L-組氨酸0. 03，酵 母 膏 5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0. 4，\\( NH4\\)2SO45，CaCO320 \\( 干熱滅菌\\) ，豆餅水解液15 mL，玉米漿 15 mL，pH 6. 7，滅菌條件均為 115℃ ，15 min。培養基必要時添加 5 μg / mL 的紅霉素。③發酵罐發酵培養基\\( g/L\\) : 葡萄糖 80，味精 12，酵母膏 18，葡萄糖酸鈉 1. 5，黃嘌呤 0. 03，L-組氨酸0. 03，\\( NH4\\)2SO412，MgSO4·7H2O 5，K2HPO42，MnSO40. 06，FeSO40. 06，CaCl22，玉米漿 15 mL，pH6. 7。其中葡萄糖分消滅菌，滅菌條件均為 115℃ ，15 min。工程菌種子培養基添加 5 μg / mL 的紅霉素。
1. 1. 4 主要試劑和儀器: Solution I 連接酶和 RNA提取試劑盒，大連寶生物工程有限公司; Taq DNA 聚合酶，北京全式金生物技術有限公司; 限制性內切酶和 1 kb DNA marker，Fermentas 公司; UltraSYBR 二步法熒光定量 PCR 試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司; 質粒小量快速提取試劑盒，北京博邁德生物技術有限公司; PCR 產物純化試劑盒和膠回收試劑盒，北京天恩澤基因科技有限公司; 引物合成與基因測序，北京華大基因。實時定量 PCR 儀，美國ABI 公司; 電穿孔儀，Eppendorf 公司; 高效液相色譜系統，美國安捷倫公司。
1. 2 感受態的制備及轉化
枯草芽孢桿菌的制作方法與轉化方法參考文獻，載體連接化學轉化感受態制備及質粒連接體系轉化均參照連接試劑盒和化學轉化試劑盒說明書進行。
1. 3 實時定量 PCR 分析
將 B． subtilis XGL 和 B． subtilis XGLF 菌株接于5 mL 搖管過夜培養，以 1% 的接種量接種于 30 mL的 LB 培養基中培養至對數期，按照 RNA 提取試劑盒說明書提取總 RNA，利用反轉錄試劑盒獲得cDNA，并以之為模板，以細菌 16S rRNA 為參比，通過實時定量 PCR，根據 2－ ΔΔCT法計算相關基因的轉錄水平。
1. 4 PRPP 轉酰胺酶活性檢測
粗酶液的制備、蛋白質定量分析和 PRPP 轉酰胺酶活性分析參見文獻。
1. 5 細胞內 IMP 含量測定
胞內 IMP 含量的測定參考 Müller 等的方法，胞內 IMP 含量的測定改進如下: 取生長至對數期的菌液 1 mL，冰浴 5 min，然后 10000 × g，4℃ 離心 1min，棄上清后加入 250 μL 去離子水重懸，加入3 μL50 mg / mL 的溶菌酶，37℃ 處理 20 min，加入 250 μL細胞裂解液，混勻后室溫下靜置 5 min，然后加入約350 μL 的細胞中和液，10000 × g，離心15 min，取上清利用 HPLC 方法測定 IMP 的含量。
1. 6 發酵培養及分析方法
搖瓶培養條件參考文獻，發酵周期為48 h。
發酵罐培養條件參考文獻，發酵過程中，取適量發酵液稀釋 20 倍后用紫外可見分光光度計測定600 nm 處的吸光度值，監測菌體生長情況。葡萄糖濃度采用 SBA-40E 生物傳感儀測定。另取適量發酵液離心后取上清，用去離子水稀釋 100 倍，將得到的稀釋液用高效液相色譜法測定腺苷含量。
2、 結果
2. 1 整合質粒的構建
以 pKS1 質粒為基本骨架構建整合質粒 pKF。分別以質粒 pWB980 與腺苷生產菌 B． subtilis XGL的基因組為模板，引物分別為 P43-S、P43-A 和 purF-S、purF-A 擴增強啟動子 P43 與基因 purF。采用重疊 PCR 的方法擴增重疊片段 P43-F，以上述 PCR 產物為模板，P43-S、purF-A 為上下游引物進行重疊PCR，擴增出重疊片段 P43-F。經限制性內切酶 Pst I和 Kpn I 雙酶切重疊片段和溫敏質粒 pKS1，切膠法回收重疊片段和載體，通過 Solution I 連接，構建整合質粒 pKF。
2. 2 質粒 pKF 整合 B． subtilis XGL
重疊片段中 purF 基因作為與基因組進行整合的位點，通過單交換整合的方式將質粒 pKF 整合到基因組上，使強啟動子 P43 插入到基因組 purF 基因的上游。構建步驟如圖 1 所示。
2. 3 相關基因的轉錄分析
通過單交換整合的方式，將強啟動子 P43 插入嘌呤操縱子中，以加強嘌呤合成途徑的通量。purF、purM、purN、purH 和 purD 作為緊鄰 P43 啟動子后的基因，其 mRNA 含量可以反映嘌呤操縱子的轉錄水平。本文對相關基因的轉錄水平進行 RT-qPCR 分析，與出發菌株 B． subtilis XGL 相比，purF 基因及其下游 purM、purN、purH 和 purD 基因的表達水平在工程菌 B． subtilis XGLF 菌株中均有不同程度的提高，分析結果見表 3。
2. 4 PRPP 轉酰胺酶活性分析
PRPP 轉酰胺酶是嘌呤合成途徑中的第一個酶，催化 5-磷酸核糖焦磷酸生成 5-磷酸核糖胺，而且是肌苷酸 IMP 合成的限速酶，其活性的高低直接影響嘌呤前體物 IMP 的生成，進而影響腺苷的合成量。酶活性分析結果\\( 圖 2\\) 表明 purF 基因的過表達使工程菌 B． subtilis XGLF 的 PRPP 轉酰胺酶的活力達到19. 2 U/g，是出發菌株 B． subtilis XGL 的2. 4倍。
2. 5 胞內 IMP 含量分析
IMP 主要是在枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑中生成的，其含量可以直接表征嘌呤合成途徑通量的強弱。此外，IMP 還是腺苷合成的重要前體物，IMP 的供應會直接影響腺苷的合成，因此，本文對枯草芽孢桿菌細胞內 IMP 的含量進行檢測分析。結果表明，工程菌 B． subtilis XGLF 胞內 IMP 含量明顯高于出發菌 B． subtilis XGL，說明 P43 啟動子的插入能夠加強嘌呤途徑合成通量，從而可增加腺苷前體物 IMP的供給量。出發菌 B． subtilis XGL 和工程菌 B．subtilis XGLF 胞內 IMP 含量見圖 2。
2. 6 腺苷發酵
為了研究嘌呤合成途徑的改造對腺苷積累的影響，本研究進行了腺苷搖瓶發酵和 5 L 發酵罐腺苷發酵，分別比較了出發菌和工程菌的生長情況、耗糖速率和腺苷產量。表 4 為腺苷搖瓶分批發酵 48 h后的發酵參數。由結果可知，與出發菌 B． subtilisXGL 比較，嘌呤合成途徑改造后的工程菌腺苷產量提高 17. 5%，糖苷轉化率提高 26. 1%，但是菌體生物量卻有所減少。由于嘌呤合成途徑的改造提高了相關基因的轉錄表達，另外，整合的重組質粒 pKF約5. 5 kb，還包含了抗性基因，這些都可能增加了工程菌生長代謝的負擔，導致菌體生長受到影響。此外，本研究在 5 L 發酵罐上進行了腺苷的分批發酵實驗。結果顯示\\( 圖 3\\) ，在同樣投入 80 g/L 葡萄糖的情況下，出發菌 B． subtilis XGL 發酵 32 h 后葡萄糖已消耗完，但腺苷對葡萄糖得率僅有 0. 092 g 腺苷/g 葡萄糖; 然而在同樣發酵時間下，工程菌 B．subtilis XGLF 的腺苷對葡萄糖得率為 0. 123g 腺苷 / g葡萄糖。
3、 討論
本實驗室前期工作中曾經利用穿梭表達質粒pBE43，構建含有 PRPP 轉酰胺酶編碼基因 purF 的重組質粒并轉入腺苷生產菌 B． subtilis XGL，試圖增加嘌呤合成途徑中限速酶量來增加腺苷合成前體物的生成，進而提高腺苷的產量。但實驗結果表明，單獨過表達 PRPP 轉酰胺酶不能提高腺苷產量，這可能是因為單個基因的過表達會導致胞內代謝通量失衡，并使終產物合成途徑中的某種中間產物積累過多而對細胞造成毒性。本研究基于代謝工程理論，對枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑進行了改造，利用單交換的方式將 P43 啟動子插入嘌呤操縱子中基因purF 上游，增加關鍵酶基因 purF 及相關基因 purM、purN、purH 和 purD 的轉錄表達水平，達到了嘌呤合成途徑增強的目的。
本研究中工程菌 B． subtilis XGLF 積累腺苷的能力增強，可能是由于 P43 啟動子的插入使 purF、purM、purN、purH 和 purD 的表達強度得到了不同程度的增強。這些基因編碼的產物谷氨酰胺、甘氨酸和 10-甲醛四氫葉酸均是嘌呤合成的前體物，同時也是嘌呤途徑的重要節點，改變這些分支節點的通量比例，使更多的嘌呤前體物進入嘌呤合成途徑，提高嘌呤合成途徑通量，從而提高腺苷產量。此外，本研究選擇在嘌呤操縱子的 purF 位點上游插入強啟動子，主要是因為 purF 編碼蛋白為嘌呤合成途徑的限速酶，該酶的過表達有助于解決代謝瓶頸。
本研究通過單交換整合的基因操作除了達到提高關鍵基因拷貝數的目的，還將龐大的嘌呤操縱子分成了 2 個較小的操縱子，從而提高嘌呤合成代謝中其它基因的轉錄水平。細胞內 IMP 含量的測定結果顯示工程菌 B． subtilis XGLF 胞內 IMP 含量升高，這說明工程菌嘌呤合成途徑得到了加強，嘌呤操縱子的改造達到了預期的效果。但是，改造后工程菌生長受到影響，耗糖速率減慢，這可能是因為重組質粒插入枯草芽孢基因組后增加了工程菌生長的負擔，導致工程菌代謝減慢，從而耗糖速率減慢。相似的結果在核黃素的研究中也被報道。因為枯草芽孢桿菌中 IMP 的生成主要來源于嘌呤合成途徑，而嘌呤合成途徑通量的增加將有利于提高腺苷產量。
下一步研究擬在工程菌 B． subtilis XGLF 的基礎上對 IMP 到腺苷的代謝途徑進行改造，如增加腺苷合成關鍵酶———腺苷琥珀酸合成酶編碼基因 purA 的拷貝數，從而增強由 IMP 至腺苷的代謝通量，可進一步提高腺苷的產量。
