甘油三酯\\(triglyceride,TG\\)是人體內含量最多的脂類,是體內能量的主要來源.TG 檢測是一項重要的臨床血脂常規測定指標.血清甘油酯測定方法可分為化學法、酶標板法和色譜法 3 大類.化學法因操作步驟繁多、技術要求高而不適于常規工作應用.

核素稀釋 / 氣相色譜 / 質譜技術\\(ID / GC / MS\\)主要用作參考系統中決定性方法的建立及參考物質的制備與定值,該方法費用昂貴,樣品處理復雜,難以推廣應用.酶標板法具有簡便快速、微量、精密度高的優點,且特異性強,易于達到終點,線性范圍寬,故臨床實驗室應用最為廣泛[1].

武漢生物制品研究所有限責任公司\\(以下簡稱武漢公司\\)血液制劑研究室研發的人血漿蛋白層析法純化工藝,主要過程為原料血漿經過各種親和層析及離子交換層析等步驟,依次獲得多種血漿蛋白制品.雜質是影響血液制品特性及質量的重要因素.研發過程中曾發現層析法純化的人血白蛋白\\(humanserum albumin,HSA\\)巴氏滅活后有不同程度的渾濁,但巴氏滅活前后樣品中白蛋白\\(albumin,ALB\\)的含量未見明顯變化,可能為血漿中的脂類析出.為了提高產品質量,我們對工藝樣品的 TG 凈含量進行監控,并以此指標來指導工藝的優化.經檢測發現,工藝樣品中確實含有 TG,采用去脂劑\\(lipid removal agent,LRA\\)優化工藝去除后,人血白蛋白原液外觀為澄明液體,符合《中國藥典》三部\\(2010 版\\)相關規定[2].

本實驗優化了酶標板法檢測 TG 凈含量的方法,進行驗證后,將其應用于監測人血白蛋白層析純化工藝中樣品的脂類含量,對工藝優化提供了指導.

1 材料與方法

1. 1 樣品 4 批原料血漿樣品包括 13001、13002批血漿和 13003、13004 批冷沉淀上清;201307003 及201307004 批人血白蛋白純化工藝樣品包括原料血漿、血漿過濾后、纖維蛋白溶解酶原的親和層析流穿液\\(Pg-FT\\)、纖維蛋白原親和層析的流穿液\\(Fg-FT\\)、IgG 親和層析的流穿液\\(IgG-FT\\)\\(加 LRA 前\\)、白蛋白親和層析上柱液\\(ALB-Load,加 LRA 后樣品\\)、Alb洗脫液\\(ALB-Elu\\);LRA 小試樣品 13004 LRA2-61、13004LRA2-62,均由本公司血液制劑研究室提供.

1. 2 標準品 標準品[TG 及游離甘油\\(free glycerin,FG\\)的起始濃度分別為 2. 5 和 0. 26 mg / ml],批號:SLBF4338,為美國 Sigma 公司產品.

1. 3 主要試劑及儀器 TG 試劑盒\\(批號:SLBD0025\\)[內含FG檢測試劑,批號:SLBB4986V;TG檢測試劑,批號:SLBB9109V]及LRA\\(批號:39339V\\)均為美國Sigma公司產品;多功能酶標儀SpectramaxPlus384及分析軟件SoftMaxPro.5.2為美國MolecularDevices公司產品.

1. 4 酶標板法檢測 TG 凈含量方法的建立1. 4. 1 FG 檢測試劑和 TG 檢測試劑的處理 按試劑的標示量用注射用水分別將試劑盒中的 FG 和 TG檢測試劑復溶,迅速顛倒混勻,置 2 ~ 8 ℃避光保存.

1. 4. 2 標準品及質控品溶液的制備 將標準品平衡至室溫,用注射用水進行 2 倍系列稀釋,共 8 個稀釋度,TG 濃度從 2 500 ~ 19. 5 μg / ml.用注射用水按 1 ∶ 5 和 1 ∶ 10 稀釋標準品,制備 2 個質控品,濃度在標準品系列的中段,TG 濃度分別為 500 和250 μg / ml.

1. 4. 3 樣品處理 樣品可直接用于檢測,如檢測結果高出檢測范圍,則稀釋樣品直至檢測值在線性范圍內.

1. 4. 4 檢測方法 開啟酶標儀 Softmax 軟件的脂類-TG 測定模板,設定波長為 540 nm,開啟加熱功能,使裝微量滴定板的托盤預溫到 37 ℃,并持續在37 ℃保溫.分別取 50 μl 注射用水\\(空白\\)、標準品系列、質控品系列或樣品加至相應的反應管中,每管加入 FG 檢測試劑 0. 8 ml,混勻 2 ~ 3 s 后,轉移至 96 孔板,200 μl / 孔,每個樣品作 3 個復孔,將96 孔板置于酶標儀托盤中,\\(37 ± 1\\)℃孵育 5 min,用酶標儀檢測 A540值,此為 FG 的吸收值;第 1 次讀數結束,取出 96 孔板,加入 TG 試劑,50 μl / 孔,混勻,同上進行第 2 次孵育和讀數,此為 TG 的吸收值.

1. 4. 5 結果計算 以標準品系列的 FG 濃度為橫坐標,以相應濃度的 FG 吸收值為縱坐標,繪制 FG 含量標準曲線,按一次方程擬合標準曲線,計算線性的相關系數,并計算質控品中的 FG 含量;以標準品系列的 TG 濃度為橫坐標,相應濃度的 TG 吸收值為縱坐標,繪制 TG 含量標準曲線,按一次方程擬合標準曲線,計算線性的相關系數,并計算質控品中的TG含量.TG 含量減去 FG 含量即為 TG 凈含量.

1. 5 方法的驗證

1. 5. 1 標準曲線線性范圍的確立 將標準品作 2倍稀釋系列\\(共 7 個稀釋度\\),使 TG 濃度從 2 500 ~19. 5 μg / m\\(lS1 ~ S7\\),作為標準品系列;將標準品一步稀釋至不同濃度\\(1 500、500、234. 5、58. 5 μg / mlTG\\)覆蓋在標準曲線的高值和低值區作為質控品系列\\(C1 ~ C4\\).每個濃度的樣品重復測定 3 次,計算各濃度樣品的吸光度均值,分別以 FG 和 TG 的濃度對其相應的吸光度值做線性回歸,R2應均不低于0. 99,各個稀釋度的變異系數\\(CV\\)不大于 15%.計算 2 條標準曲線下各稀釋度質控品的 FG 和 TG 的回收率\\(可接受標準為 90% ~ 110%\\),確定標準曲線的線性范圍.

1. 5. 2 準確度 取 TG 濃度為 2 500 μg / ml 的標準品和樣品 13004LRA2-62,以 0 ∶ 1、1 ∶ 7、1 ∶ 3 和 1 ∶ 1\\(即低、中、高濃度\\)的比例混合,按建立的方法進行檢測.取平均值計算樣品中 FG、TG 含量及 TG 凈含量,并計算回收率\\(可接受標準為 90% ~ 110%\\).

1. 5. 3 精密度1. 5. 3. 1 重復性 取樣品 13004LRA2-61,按建立的方法,由同一個實驗員在同一試驗中連續測定 6 次,計算 CV\\(可接受標準為 CV ≤ 10%\\).

1. 5. 3. 2 中間精密度 取樣品 13004LRA2-61,按建立的方法,由不同的實驗員在不同日期內分別測定 3 次,計算 CV\\(可接受標準為 CV ≤ 10%\\).

1. 6 方法的初步應用

1. 6. 1 TG 含量的檢測在蛋白純化工藝中的應用用建立的方法檢測 4 批混合原料血漿中的 TG 凈含量,初步建立工藝數據;檢測 201307003 和 201307004批中間品\\(原料血漿、Pg-FT、Fg-FT、IgG-FT\\)的 TG 凈含量,監測工藝流程中 TG 的流向.

1. 6. 2 LRA 在白蛋白純化工藝中的應用 取201307004 批 IgG-FT,采用低溫乙醇法制備白蛋白常用的硅藻土濃度,處理樣品,經 1 μm 濾膜過濾后,收集上清;取同批 IgG-FT,加入不同量的 LRA\\(A、B、C 方案\\),LRA 用量:A 方案 = C 方案 < B 方案,攪拌時間:A 方案 < B 方案 = C 方案,經 1 μm 濾膜過濾后,收集上清.用建立的方法檢測 TG 凈含量,分析各組檢測結果,獲得 LRA 最佳應用條件.

2 結 果

2. 1 酶標板上的 TG 凈含量檢測方法的建立 檢測結果顯示,FG 的標準曲線線性回歸方程為 Y = 0. 002 +0. 003 93 X,R2= 0. 999;TG 的標準曲線線性回歸方程為 Y = 0. 061 2 + 0. 000 407 X,R2= 1;2 個質控品系列的回收率在90% ~ 110%,CV < 10%.表明由傳統的試管法改為酶標板法是可行的.因為S-8的A540值極低,且 CV > 10%,故標準曲線范圍暫定在S-1 ~ S-7.

2. 2 方法的驗證

2. 2. 1 線性范圍 FG 的標準曲線線性回歸方程為:Y = 0. 005 25 + 0. 004 11 X,R2= 0. 997;TG 的標準曲線線性回歸方程為:Y = 0. 009 74 + 0. 000 427 X,R2= 0. 997.質控品 4\\(TG:58. 5 μg / ml,FG:6 μg / ml\\)回收率不合格,因此,確定該方法檢測的線性范圍在S-1 ~ S-6 \\(即 TG:78 ~ 2 500 μg / ml;FG:8. 13 ~260 μg / ml\\)之間.見表 1 和表 2.

2. 2. 2 準確度 檢測結果顯示,在標準曲線的有效范圍內,各樣品的 CV 均< 4%,回收率在 102% ~107%之間,準確度較好.見表 3.

2. 2. 3 精密度 檢測結果顯示,同一樣品由同一個實驗員在同一試驗中連續測定 6 次和由不同的實驗員在不同日期內分別測定 3 次的結果的 CV 均<3%,精密度較好.見表 4 和表 5.

2. 3 方法的初步應用

2. 3. 1 TG 含量的檢測在蛋白純化工藝中的應用檢測結果顯示,4批混合原料血漿\\(13001、13002批血漿及 13003、13004 批冷沉淀上清\\)的 TG 凈含量分別為1 388. 256、1 161. 504、1 388. 651、1 280. 362 μg / ml.冷沉淀前后血漿中脂類含量未見明顯變化.2013-07003 和 201307004 批原料血漿及 3 步親和層析的流穿液檢測結果顯示,血漿中的脂類物質隨著工藝走向主要存在于親和層析的流穿液中,見表 6.

2. 3. 2 LRA 在白蛋白純化工藝中的應用 結果顯示,在白蛋白分離純化工藝中采用去脂劑可將脂類去除,效果優于硅藻土.綜合 LRA 用量,工藝時間等因素,將 B 方案作為最終方案,見表 7.

3 討 論

TG 的檢測目前在臨床上主要用于監測不同階段的人群的TG.TG的正常參考值為:兒童< l 000 μg / ml\\(1. 13 mmol / L\\),成人< 1 500 μg / ml\\(1. 7 mmol / L\\)[3].本實驗檢測的原料血漿及去冷沉淀血漿數據與成人標準相符.脂肪組織中的 TG 在一系列脂肪酶的作用下,分解生成甘油和脂肪酸,并釋放入血液,供其他組織利用的過程,稱為脂動員.脂動員生成的脂肪酸可釋放入血液,與白蛋白結合形成脂酸白蛋白運輸至其他組織被利用.從上述脂肪的分解代謝過程可以看到,白蛋白是主要的脂肪酸載體.由本公司血漿蛋白層析純化工藝 TG 監測結果可知,工藝中 TG 主要存在于白蛋白分離部分,與理論相符.

在白蛋白分離純化工藝中采用去脂劑可將脂類去除,效果優于硅藻土.LRA 用量 A 方案 = C 方案

TG 的早期測定方法是以總脂質與膽固醇和磷脂之差估算.化學法用有機溶劑抽提標本中的 TG,去除抽提液中磷脂等干擾物后,用堿水解\\(皂化\\)TG,以過碘酸氧化甘油生成甲醛,然后用顯色反應檢測甲醛.比較準確的是二氯甲烷-硅酸-變色酸法\\(vanhandel-caslson 法\\),該方法抽提完全,能去除磷脂及甘油干擾,變色酸顯色靈敏度高,顯色穩定,至今仍是美國疾病控制與預防中心\\(CDC\\)內部參考方法.但因操作步驟繁多、技術要求高而不適于常規工作應用.

目前幾乎所有的臨床實驗室均采用酶標板法檢測血清 TG 水平.如脂蛋白脂肪酶-甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法\\(GPO-PAP法\\).其反應原理如下:①血清中 TG 在脂肪酶\\(lipo-prteinlipase,LPL\\)作用下,水解為甘油和游離脂肪酸\\(freefattyacids,FFA\\);②甘油在ATP和甘油激酶\\(glyc-erokinase,GK\\)作用下,生成 3-磷酸甘油;③3-磷酸甘油經磷酸甘油氧化酶\\(glycerophosphate oxidase,GPO\\)作用氧化生成磷酸二羥丙酮和 H2O2;④H2O2與 4-氨基安替比林\\(4-aminoantipyrine,4-AAP\\)及 4-氯酚在過氧化物酶\\(peroxidase,POD\\)作用下,生成紅色醌類化合物,其在 540 nm 的吸收值與 TG 濃度成正比.

酶標板法分一步法和兩步法,用一步法測定的是血清總甘油酯\\(定義為 TG 和 FG 及少量甘油二酯、甘油一酯之和\\),為了消除 FG 的干擾,中華醫學會檢驗分會曾在《關于臨床血脂測定的建議》文件中推薦GPO-PAP 法的兩步酶標板法作為血清 TG 常規測定方法[4].該方法是內游離甘油空白法,即將試劑中的脂肪酶與其他試劑成分分開,樣品先與不含脂肪酶的試劑混合,孵育后測定吸光度,加入脂肪酶孵育后再測定吸光度,用兩吸光度之差計算 TG 濃度.為消除 FG 對檢測結果的影響,本實驗采用美國 Sigma 公司的TG 試劑盒方法 A 即采用 GPO-PAP 的內游離甘油空白法.

由于酶標儀的出現,微量滴定板上的比色所具有的高通量、高效率的特點獲得極大的發揮,我們根據前期 BCA 法檢測總蛋白[5]的經驗,也嘗試著將常規的試管比色法改進為微量滴定板和酶標儀快速測定法,即第一步反應增加樣品與游離甘油試劑的反應比例\\(從標示的 1 ∶ 80 提高到 1 ∶ 16\\),取部分混合樣品至微量滴定板上進行孵育,第二步反應的樣品與脂肪酶的比例仍為 4 ∶ 1,兩步的反應模式均為37 ℃孵育 5 min.該方法驗證結果顯示,準確度、精密度均符合驗證要求.我們將該方法引入血漿層析純化工藝的監測,既能幫助優化工藝,又能作為質量控制的一部分來監控工藝的穩定性,擴大了該方法的適用范圍.

參考文獻

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[2] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of People′sRepublic of China\\(Vol Ⅲ\\)[S]. Beijing:China Med Sci Press,2010:212-213.\\(in Chinese\\)國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典\\(三部\\)[S]. 北京:中國醫藥科技出版社,2010:212-213.

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[4] Serum triglyceride determination kit product description[OL].\\(2013-09-23\\)[2014-08-23].

[5] Zhou ZJ,Li CS,Li TJ,et al. Optimization and verification ofBCA method for determination of protein content in human coagulation factor Ⅷ [J]. Chin J Biologicals,2013,26\\(10\\):1488-1492.\\(in Chinese\\)周志軍,李策生,李陶敬,等. 檢測人凝血因子Ⅷ蛋白質含量的 BCA 法的優化及驗證[J]. 中國生物制品學雜志,2013,26\\(10\\):1488-1492.