1、 引言

DNA 是染色體的主要化學成分, 是儲存、復制和傳遞遺傳信息的物質基礎, 在生物體的生長、發育和繁殖等生命活動中發揮著重要的作用. DNA 的雙鏈結構對于維持遺傳物質的穩定性和復制的準確性極為重要, 其拓撲結構的變化與細胞凋亡和腫瘤發生密切相關. 近年來, 深入研究 DNA 的結構和功能以及金屬配合物與 DNA 之間的相互作用成為生物無機化學的研究熱點, 尤其是釕配合物與DNA之間的相互作用引起了廣泛關注[1~4]. 釕配合物具有良好的熱力學穩定性, 豐富的光化學、光物理和氧化還原特性, 以及低毒性、易吸收并可很快排泄的特點, 使其成為繼鉑類藥物之后最有前途的抗癌藥物之一. 已有研究發現, 抗癌藥物由于能阻滯 DNA前體的合成, 或阻止 DNA 復制, 或直接破壞癌細胞DNA, 致使癌細胞的生長繁殖受到抑制, 促使癌細胞凋亡, 因此, 釕配合物斷裂 DNA 的研究對于釕類抗癌藥物的研發具有重要的意義. 本文列舉了近年來一些代表性的研究工作, 簡要綜述釕配合物誘導DNA 斷裂以及作用機理的研究進展.

2、 釕配合物的 DNA 斷裂機理

根據文獻報道, 許多釕配合物包括單核、雙核和雜核等不同組成與結構的釕配合物均具有斷裂 DNA的作用. 釕配合物對 DNA 的斷裂可采用凝膠電泳技術進行研究. 質粒 DNA 有三種構型: \\(1\\) 兩條主鏈均完整的閉合環狀 DNA 分子, 以超螺旋形式存在, 稱為超螺旋質粒\\(Form I\\); \\(2\\) 僅一條主鏈保持完整的開環質粒 DNA 分子, 具有游離末端, 稱為開環質粒\\(FormII\\); \\(3\\) 兩條主鏈均已斷裂的線性質粒 DNA 分子, 稱為線性質粒\\(Form III\\). 三種構型的質粒 DNA 在瓊脂糖凝膠中的遷移速率為: 超螺旋質粒 > 線性質粒 >開環質粒. 通常情況下, 質粒 DNA 主要以超螺旋構型存在, 當與釕配合物作用時會斷裂為開環質?；騖\(和\\)線性質粒. 由于它們在凝膠中具有不同的泳動速率,經溴化乙啶\\(EB\\)染色后進行紫外觀察即可看到不同的DNA 條帶\\(圖 1\\).

雖然釕配合物斷裂 DNA 后均產生開環質?；騖\(和\\)線性質粒, 但其斷裂機理卻不相同. 根據文獻報道, 釕配合物斷裂 DNA 的機理包括水解機理、活性氧機理、氧化還原機理及碳類自由基機理等.

2.1 水解機理

水解機理是指釕配合物通過促使 DNA 結構中的磷酸二酯鍵水解而造成斷裂, 水解斷裂的產物在DNA 連接酶的作用下重新連接. 在釕配合物斷裂DNA 的研究中, 水解機理并不常見.

Barton 等發現，在金屬離子 Cu\\(II\\)、Co\\(II\\)、Zn\\(II\\)、Cd\\(II\\)和 Pb\\(II\\)催化下, Ru\\(DIP\\)2Macron+\\(1, 圖2\\)能夠使 pBR322 DNA 以水解方式斷裂, 斷裂效率為Cu\\(II\\) > Co\\(II\\) > Zn\\(II\\) ≈ Cd\\(II\\) ≈ Pb\\(II\\). Macro 是螯合配體, 可以與金屬離子配位結合, 當 Ru\\(DIP\\)2Macron+與 DNA 鍵合時，金屬離子作為親核試劑進攻DNA 的磷酸骨架, 造成 DNA 磷酸二酯鍵水解而斷裂. 在 T4 DNA 連接酶作用下, 非氧化還原活性離子Zn\\(II\\)、Cd\\(II\\)和 Pb\\(II\\)催化得到的 DNA 斷裂產物可以大部分連接起來, 這證明了斷裂機理屬于水解機理; 而氧化還原活性離子 Cu\\(II\\)和 Co\\(II\\)催化得到的DNA 斷裂產物只有少部分連接起來, 推斷可能是水解機理和其他氧化還原反應共同作用的結果.

Deshpande 等發現，[Ru\\(N-N\\)2\\(BPG\\)]2+\\(2~5,圖 3\\)、[Ru\\(N-N\\)\\(BPG\\)2]2+\\(6~9, 圖 3\\)和[Ru\\(BPG\\)3]2+\\(10, 圖 3\\)系列配合物可以水解斷裂 pBR322 DNA,其中[Ru\\(dppz\\)2\\(BPG\\)]2+\\(5\\)和[Ru\\(bpy\\)\\(BPG\\)2]2+\\(6\\)的斷裂效率最高, 其在 37℃保溫 18 h 后幾乎將 DNA 完全斷裂. 因此推斷, 輔助配體 BPG 中的 N–H 與 DNA磷酸骨架中的氧原子形成氫鍵與該系列配合物以水解途徑斷裂 DNA 有關.

2.2 活性氧機理活性氧機理是指在氧氣存在的條件下, 釕物經一定波長的光照射后通過能量轉移至3O2產生1O2, 以及通過電子轉移產生2O·-和 OH·,1O2、2O·-和OH·活性氧物種, 可以從脫氧核糖骨架中脫氫，即氧化脫氧核糖骨架而造成 DNA 斷裂. 在釕配合物斷裂DNA 的機理中, 活性氧機理最常見. 表 1 總結了文獻中報道的涉及活性氧機理斷裂 DNA 的釕配合物. 在這些釕配合物中, 有些主要通過1O2斷裂 DNA, 有些主要通過1O2和 OH·斷裂 DNA, 有些主要通過1O2和2O·-斷裂 DNA, 個別配合物主要通過 OH·斷裂DNA, 還有些配合物雖然沒有明確的結論, 但根據實驗推斷其為活性氧機理. 從這些機理中可以看出,1O2是釕配合物斷裂 DNA 最關鍵的活性氧物種.

釕配合物的1O2產生量子效率可通過 1,3-二苯基異苯并呋喃\\(DPBF\\)法來測定. 當用 405 nm 波長的單色光對DPBF進行激發時, DPBF會發射熒光, 在479 nm 處出現一個發射峰. 若將一定濃度的 DPBF與光敏試劑—釕配合物混合在一起, 并用 480 nm的單色光進行照射, 則釕配合物產生的1O2會與DPBF 反應, 使 DPBF 濃度減小, 如圖 4 所示. 因此,隨著 DPBF 與單線態氧的反應, DPBF 的熒光強度逐漸降低. DPBF 濃度的減小、DPBF 熒光強度的降低和光照時間符合下述關系式:

-D[DPBF]/t = \\(I0– It\\)/t = IinFabFDFr\\(1\\)k/ks= FabFD/FabsFΔs\\(2\\)

式中 Iin為照射的單色光強度, I0和 It分別為未經單色光照射之前和照射 t 時間后 DPBF 的熒光強度, Fab為光敏試劑即釕配合物的吸收光效率, FD為釕配合物的1O2產生的量子效率, Fr為與 DPBF 反應的單線態氧的量子效率, 角標 s 代表參比物[Ru\\(bpy\\)3]2+. 用\\(I0- It\\)或\\(I0- It\\)/I0對 t 作圖, 得到一條直線, 斜率為 k.當這種釕配合物是參比物[Ru\\(bpy\\)3]2+時, 直線的斜率為ks. 樣品釕配合物與參比物[Ru\\(bpy\\)3]2+的吸收光效率Fab和Fabs可通過相同濃度下它們在480 nm處的吸光度得到. [Ru\\(bpy\\)3]2+的1O2產生量子效率FDs已知,在甲醇溶液中為 0.81, 在乙腈溶液中為 0.57, 因此,根據式\\(2\\)即可求得樣品釕配合物的FD值. 文獻中報道的一些釕配合物FD值見表 2, 其中 Ru-2An \\(11, 圖5\\) 最 高 , 為 0.96; [Ru\\(bpy\\)2\\(dppz\\)]2+最 低 , 僅0.09.

據研究發現, 釕配合物的1O2產生量子效率與其3MLCT 激發態的壽命相關,3MLCT 激發態的壽命越長,1O2的產生量子效率越高. 例如, [Ru\\(bpy\\)2-\\(mitatp\\)]2+\\(12, 圖 5\\)和[Ru\\(bpy\\)2\\(nitatp\\)]2+\\(13, 圖 5\\)的3MLCT 激發態壽命分別為 427 和 355 ns, 其1O2產生量子效率分別為 0.43 和 0.36; [Ru\\(bpy\\)2\\(dpb\\)]2+

\\(14, 圖 5\\) 、 [Ru\\(bpy\\)\\(dpb\\)\\(dppn\\)]2+\\(15, 圖 5\\) 和[Ru\\(bpy\\)2\\(dppn\\)]2+\\(16，圖 5\\)的3MLCT 激發態壽命為66、229 和 13000 ns, 其1O2產生量子效率為 0.22、0.43和 0.79. 釕配合物的1O2產生量子效率與其斷裂DNA 的能力相關, 一般地, 釕配合物的1O2產生量子效率越高, 其斷裂 DNA 的能力越強, 表 2 中許多釕配合物的實驗結果證明了這一點. 本課題組在研究中發現, 配合物[Ru\\(bpy\\)2\\(fip\\)]2+\\(17, 圖 5\\)、[Ru\\(bpy\\)2\\(Happip\\)]2+\\(18，圖 5\\)、[Ru\\(bpy\\)2\\(pip\\)]2+\\(19, 圖 5\\)、[Ru\\(bpy\\)2\\(Htip\\)]2+\\(20, 圖 5\\)和[Ru2\\(bpy\\)4\\(H2bipt\\)]4+\\(21,圖 5\\)均能以活性氧機理斷裂 pUC18 DNA, 而且通過DPBF 法測得它們的1O2產生量子效率分別為 0.50、0.33、0.37、0.42 和 0.46, 其中結構相似的配合物 17、18、19 和 20 的 DNA 斷裂效率順序為 17 > 20 > 19 > 18,同樣含有噻吩結構的雙核配合物 21 與單核配合物 20的 DNA 斷裂效率順序為 21 > 20, 這與其1O2產生量子效率的高低一致.

除1O2的產生量子效率外, 釕配合物與 DNA 的鍵合強度也被認為是其斷裂 DNA 的影響因素. 在具有相似結構的釕配合物中, 與 DNA 鍵合強度越大的配合物斷裂 DNA 的能力越強, 表 3 中釕配合物的實驗結果支持此結論. 此外, 釕配合物中取代基的給電子能力也被認為與其斷裂 DNA 的能力有關. 取代基的給電子能力越強, 配合物斷裂 DNA 的效率越高, 如 N\\(CH3\\)2、NH2、OCH3、H 和 NO2的給電子能力為 N\\(CH3\\)2> NH2>OCH3H 或者 NO2, 相應釕配合物斷裂 DNA 的能力為[Ru\\(tpy\\)\\(dppz\\)\\(py-N\\(CH3\\)2\\)]2+> [Ru\\(tpy\\)\\(dppz\\)\\(py-NH2\\)]2+> [Ru\\(tpy\\)\\(dppz\\)\\(py-OCH3\\)\\)]2+[Ru\\(tpy\\)\\(dppz\\)\\(py\\)]2+或[Ru\\(tpy\\)\\(dppz\\)\\(py-NO2\\)]2+. 此外, 本課題組還發現, 有些配合物在高濃度時會使 DNA 產生沉淀現象, 因而只能在低濃度條件下測定該配合物的 DNA 斷裂情況, 如配合物 21 只能在 2 μmol/L 以下研究其 DNA 斷裂能力, 因此, 配合物對 DNA 的沉淀作用也是影響其斷裂 DNA 的因素。

值得注意的是, 上述因素對釕配合物 DNA 斷裂能力的影響并不是絕對的, 有時會出現相悖的情況,這是多種影響因素共同作用的結果. 例如, 配合物12的DNA鍵合常數\\(8.38±0.3\\) × 106L/mol 小于配合物 13的\\(1.07±0.4\\) × 107L/mol, 但 12 的 DNA 斷裂效率卻高于 13, 這是因為 12 的3MLCT 激發態壽命\\(427 ns\\)和1O2產生量子效率\\(0.43\\)均大于 13 \\(355 ns, 0.36\\).

2.3 氧化還原機理

氧化還原機理是指在外加還原劑或氧化劑的輔助作用下釕配合物對質粒 DNA 的斷裂過程. 例如,[Ru\\(NH3\\)4\\(diimine\\)]2+\\(diimine = bpy、phen、5,6-dmp、4,7-dmp、2,9-dmp 和 Me4phen\\) \\(22~27, 圖 6\\)和[Ru\\(NH3\\)4\\(L\\)]2+\\(L = ip、pip、hpip、dip、qdppz\\) \\(28~32,圖 6\\)系列配合物在氧化劑氧氣和還原劑抗壞血酸鈉作用下使 pBR322 DNA 產生了斷裂現象, 其中[Ru\\(NH3\\)4\\(diimine\\)]2+\\(diimine = 5,6-dmp、2,9-dmp、Me4phen\\) \\(24、26 和 27, 圖 6\\)和[Ru\\(NH3\\)4\\(L\\)]2+\\(L =qdppz\\) \\(32, 圖 6\\)的斷裂能力最強, 推斷是反應過程中產生的 HO·從 DNA 分子中抽取氫原子, 使糖骨架碎裂, 堿基釋放, 最終造成 DNA 斷裂. 還有研究發現, 釕配合物在光照無氧情況下會斷裂 DNA,

原子所帶的正電荷顯著高于基態. 如配合物 19 的電荷分布中 Ru原子由基態時的 0.9750增加到激發單線態的 1.1757 和三線態的 1.1823. 也因此, 激發態的Ru 原子比基態時具有更強的氧化性. 由于主配體接受了中心 Ru 原子轉移過來的電子, 主配體在激發態時所帶的正電荷明顯低于基態. 如配合物 19 的電荷分布中主配體由基態時的 0.3425 減小到激發單線態的 0.2983 和三線態的 0.2789, 而且配合物已占軌道中的電子會激發到空軌道中, 因而主配體與 DNA 堿基對之間的相互作用大幅度減弱, 也同時使得 DNA堿基對的還原能力增強. 與基態時相比, 激發態時\\(Ru–N\\)m和\\(Ru–N\\)co\\(m = 主配體, co = 輔助配體\\)鍵長大幅度增加, 鍵角\\(N–Ru–N\\)m明顯減小. 如配合物19 激發單線態時 \\(Ru–N\\)m和\\(Ru–N\\)co鍵長分別為0.2249 和 0.2329 nm, 大于基態的 0.2181 和 0.2177 nm;激發單線態時鍵角\\(N–Ru–N\\)m為 75.5°, 小于基態的77.5°. 因此, 激發態時, 中心 Ru 原子與配體之間的相互作用顯著減弱. 這些結果說明, 釕配合物在激發態時近似于具有強氧化性的三價釕離子, 它靠近DNA 并氧化 DNA 的堿基對, 最終導致 DNA 斷裂.

4、 結論與展望

綜上所述, 對于釕配合物與 DNA 相互作用的研究已有較多報道, 但釕配合物斷裂 DNA 的詳細作用機制還需進一步深入闡釋, 釕配合物對 DNA 的斷裂與其抗腫瘤作用之間的關系也需深入研究, 這些研究對于理解生命的過程及調控, 合成篩選出高效、廣譜、低毒副作用的釕類抗腫瘤藥物有著極為重要的意義.

致謝：

本工作得到國家自然科學基金\\(21171022, 90922004\\)和北京師范大學分析測試基金資助, 特此一并致謝.

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