衰老現象在自然界中廣泛存在，它是一種內源的逐漸發生的并會對發生個體產生持續性損害的過程．在關于衰老發生的理論假說中，衰老的自由基假說\\(the free radical theory of aging\\)自 20 世紀 50年代提出伊始，便受到廣泛關注，與端粒酶假說、細胞分裂極限假說等成為推動衰老基礎研究的重要假說之一．該假說認為過多的氧化還原活性自由基能夠造成生物大分子的氧化損傷，導致衰老．研究發現，伴隨衰老的發生發展，線粒體產生的過氧化氫增多，機體氧化損傷增加，而過表達抗氧化酶的轉基因果蠅壽命延長，這些結果都支持了衰老的自由基假說．在最近發表的關于衰老標志的綜述中，作者列舉了基因組不穩定、端?？s短、表觀遺傳改變、蛋白質穩態異常、營養感受異常、線粒體功能紊亂、細胞衰老、干細胞耗竭、細胞通訊障礙九個方面的衰老標志，其中基因組不穩定及線粒體功能紊亂與活性氧有直接關系，其他方面也存在間接調控．因此，細胞的氧化還原調控是衰老研究中的重要問題，衰老過程中氧化還原調控機制的研究對揭示衰老機制和延緩衰老及健康衰老具有重要意義．
1、細胞氧化還原平衡調控與衰老
細胞內有一套完整的氧化系統和還原系統，氧化系統主要包括活性氧 / 活性氮 \\(ROS/RNS：reactive oxygen/nitrogen species\\)兩大 “家族”， 其中活性氧 \\(ROS\\)包括 O2·，HO·，HO2·，H2O2，1O2,RO·，ROO·\\(R 表示烷基\\)等，活性氮\\(RNS\\)包括NO，ONOO-，NO+，N2O3等．主要產生自線粒體、過氧化物酶體、NADPH 氧化酶、 細胞色素 P450、黃嘌呤氧化還原酶系統等，外源主要與紫外線、電離輻射、環境毒素等有關．而還原系統主要包括大分子抗氧化酶類\\(如：超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等\\)和小分子抗氧化劑\\(如：谷胱甘肽、維生素 C、維生素 E 等\\)．硫氧還蛋白系統和谷氧還蛋白系統是重要的內源抗氧化系統．二硫鍵異構酶 PDI 及熱休克蛋白也在氧化還原平衡調控中有重要作用．正常情況下，氧化系統與還原系統處于有機平衡，細胞功能正常．一旦氧化系統與還原系統失去平衡，細胞氧化還原環境受到破壞，表現出應激和功能異常，持續不平衡將導致衰老及相關疾病，如：動脈硬化、糖尿病、癌癥、神經退行性疾病等都與氧化還原失衡密切相關．尤其是氧化損傷占主導時，生物大分子功能受到破壞，導致衰老發生，即自由基衰老學說的核心思想 \\(圖 1\\)．
氧化還原平衡調控與衰老密切相關．超氧化物歧化酶 SOD 對于細胞氧化還原平衡的維持至關重要，過表達 SOD 能夠延長果蠅壽命； SOD2 敲除的 MEF 細胞及小鼠皮膚較之野生型細胞更易發生損傷與老化．過氧化氫酶\\(catalase，CAT\\)作用于SOD下游，是細胞應對氧化應激的重要抗氧化酶之一．CAT 在內皮細胞的病理進程中起重要作用，針對法國人群的研究表明 CAT 能夠延緩動脈衰老.
另一類重要的自由基清除蛋白是谷胱甘肽過氧化酶\\(glutathione peroxidase，GPx\\)，除了能夠清除胞內的過氧化氫之外，GPx 還能夠清除過氧化的脂質物質，有研究表明其與心血管疾病的發生存在聯系．硫氧還蛋白\\(thioredoxin，TRX\\)是一個氧化還原酶家族，能夠可逆地還原二硫鍵；通過去除過氧化氫，硫氧還蛋白能夠幫助降低細胞氧化應激水平，提高細胞抗氧化能力．氧化后的 TRX 通過硫氧還蛋白還原酶\\(thioredoxin reductase，TRXR\\)進行還原再生，TRXR 是一種含硒蛋白，它對 TRX 的還原依賴于 NADPH．同時，硫氧還蛋白結合蛋白2\\(trx-binding protein-2，TBP-2\\)能夠調控 TRX 的活性．TBP-2 的缺失則會導致脂質代謝失常，這些過程均與衰老過程密切相關．研究發現，參與 GSH生物合成的關鍵限速酶 GCL 活性會隨年齡增長降低，在果蠅中過表達 GCL 能夠延長壽命 50%．針對酵母衰老時程的研究表明，在衰老過程早期胞內NADPH急劇減少，繼而引發 NADPH 依賴的氧化還原酶\\(如 TRXR、GR 等\\)氧化失活，造成氧化還原嚴重失衡，導致含巰基蛋白的大量氧化，氧化還原嚴重失衡．
2、氧化還原與信號轉導
隨著細胞分子生物學的快速發展，人們發現活性氧、活性氮等在細胞信號轉導中發揮重要作用，如精原干細胞的自我更新就需要活性氧．一氧化氮自由基\\(NO\\)作為氣體信號分子，在免疫系統、心腦血管系統和神經系統發揮重要作用．近年研究表明：NO 能夠對蛋白質半胱氨酸自由巰基修飾，將—SH 轉變為—SNO，即蛋白質巰基亞硝基化修飾． 因此，關于細胞氧化還原調控在生命中的作用及在衰老中的作用需要重新和全面認識．這里以一氧化氮為例闡述其如何通過對蛋白質自由巰基亞硝基化修飾\\(S-nitrosylation，S-nitrosation\\)調控蛋白質的功能和信號轉導\\(圖 2\\)．
2．1巰基亞硝基化對蛋白質活性的調控
在巰基亞硝基化的早期研究中，很多代謝相關的酶被鑒定為亞硝基化的靶點，這些酶大多具有活性半胱氨酸殘基，在亞硝基化的修飾作用下，活性位點受到影響，活性也受到影響，如 GAPDH 的Cys194、谷胱甘肽還原酶\\(glutathione reductase,GR\\)的 Cys63、肌酸激酶\\(creatine kinase, CK\\) 的Cys283，代謝酶活性的改變導致代謝反應失常．后來越來越多的研究發現，巰基亞硝基化修飾不僅僅影響代謝酶類，許多激酶與磷酸酶、膜受體與離子通道、轉錄因子的活性也都受到巰基亞硝基化的影響．激酶與磷酸酶的亞硝基化后活性的改變直接影響了磷酸化信號的傳遞，如JNK、蛋白激酶C \\(PKC\\)、蛋白酪氨酸磷酸酶 1B \\(PTP1B\\)、PTEN等；膜受體與離子通道的亞硝基化可能會影響信號向下游的傳遞，如NMDA 受體\\(NMDAR\\)亞硝基化后活性降低，抑制了下游信號通路、雷諾定受體\\(RyR\\)亞硝基化后活性升高，激活了下游信號通路；亞硝基化能夠通過影響轉錄因子與DNA 的結合來調控其轉錄活性，如 AP-1、NF-κB的亞硝基化均抑制了其與 DNA 的結合能力．
2．2巰基亞硝基化對蛋白質定位的調控
關于巰基亞硝基化影響蛋白質定位的研究較少，就目前的報道來看，巰基亞硝基化能夠影響一些蛋白質在細胞質與細胞核之間的轉運．原本定位于細胞質內的代謝酶 GAPDH 亞硝基化之后與Siah1 蛋白結合能力增強，后者的核輸入信號導致二者共同向細胞核內轉運，巰基亞硝基化解釋了不具備核輸入信號的GAPDH 入核的機制．巰基亞硝基化對蛋白質定位的調控也是本課題組近年來關注的科學問題，我們的研究發現：NO 通過亞硝基化修飾 93 位以及 310 位半胱氨酸調控 DNA 修復蛋白APE1的核輸出，同時破壞了 importin 介導的核輸入系統導致 APE1 在核內全部清空；NO 通過對核輸出受體蛋白\\(CRM1\\)的亞硝基化修飾，削弱了其與核輸出信號 NES 的結合，導致對經典核輸出通路的抑制．前者是巰基亞硝基化對蛋白質本身定位的影響，后者是巰基亞硝基化通過對核轉運蛋白的調控影響其他蛋白質的定位．
2．3巰基亞硝基化對蛋白質穩定性的調控
蛋白質的泛素化途徑是調控其穩定性的主要機制之一．巰基亞硝基化修飾可通過影響泛素化途徑來調控蛋白質的穩定性．這包括兩個層次的意義：
首先，巰基亞硝基化可影響單個蛋白質的泛素化，對于不同的蛋白質，巰基亞硝基化可能促進其泛素化水平，降低蛋白質穩定性，如 FLICE 樣抑制蛋白\\(FLIP\\)，也可能降低其泛素化水平，從而維持該蛋白的穩定性，如缺氧誘導因子 1 \\(HIF-1\\)、Bcl-2；其次，泛素化系統中關鍵酶的巰基亞硝基化會影響其底物的穩定性，如巰基亞硝基化抑制了泛素 E3 連接酶 Parkin 的活性，造成其底物蛋白質的降解受到抑制，α-synuclein \\(α突觸核蛋白\\)、synphilin-1等的大量聚集引起多巴胺能神經元的大量凋亡．
2．4巰基亞硝基化對蛋白質-蛋白質相互作用的調控
生物體細胞內的蛋白質相互作用網絡是信號轉導和一切生理病理過程發生的基礎，巰基亞硝基化對蛋白質相互作用的調控也是亞硝基化行使功能的重要機制之一．GAPDH 由細胞質向細胞核轉位之前，巰基亞硝基化增強其與Siah 的相互作用就是亞硝基化影響蛋白質相互作用的例證之一．此外，N- 乙基馬來酰亞胺敏感因子\\(NSF\\)的亞硝基化能夠增強其與AMDA 受體\\(AMDAR\\) GluR2 亞基的結合，從而調控 AMDAR 下游信號通路．p53的77位半胱氨酸殘基的亞硝基化能夠抑制其與泛素E3連接酶 HDM2 結合，避免其被降解．
2．5巰基亞硝基化對蛋白質發生其他類型翻譯后修飾的調控
巰基亞硝基化影響其他類型翻譯后修飾的情況也普遍存在．巰基亞硝基化通過對激酶或磷酸酶活性的影響，調控其底物的磷酸化水平，造成某種生理或病理上的效應，如在胰島素抵抗過程中，胰島素受體、胰島素受體底物以及 Akt 的酪氨酸磷酸化水平的降低與其亞硝基化水平的升高相關．蛋白質氧化修飾也受到巰基亞硝基化修飾的影響，有報道指出，蛋白質巰基亞硝基化能夠抑制其受到不可逆氧化修飾的影響，防止其受到氧化應激的損傷，從而起到保護的作用，如巰基亞硝基化對硫氧還蛋白和 PTP1B的保護作用．此外，組蛋白去乙?；?HDAC2 的巰基亞硝基化能促使其從染色質上解離，增強組蛋白的乙?；?，調控轉錄，Sumo 化 E3 連接酶 Pias3 的巰基亞硝基化促使其經泛素途徑降解，導致細胞 sumo 化整體水平的降低.
巰基亞硝基化對蛋白質其他類型翻譯后修飾的調控是信號通路之間發生交互作用\\(crosstalk\\)的重要機制.
3、生物大分子氧化損傷與衰老
3．1 DNA的氧化損傷與修復
氧化還原失衡，尤其是當羥自由基這樣強氧化的自由基過多時，會造成 DNA 斷裂、突變等氧化損傷，8- 羥基 -2′- 脫氧鳥嘌呤核苷\\(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG\\)是 DNA 氧化損傷的最主要產物和標記物．細胞具有多種 DNA 損傷響應機制，能夠及時感知這些損傷，并啟動相應的修復通路進行修復．但是，當這些損傷超出了細胞的修復能力，DNA 突變逐漸積累，細胞基因組穩定性下降．基因組不穩定是衰老過程中的重要標志．另一方面，線粒體作為內源自由基的主要來源之一，線粒體DNA 極易受到氧化損傷．對于多個物種、多個組織的研究均表明，伴隨衰老進程，線粒體DNA \\(mtDNA\\)突變累積．伴隨衰老過程線粒體ROS 增加，細胞氧化應激水平升高，氧化還原敏感的堿基切除修復\\(base excision repair，BER\\)關鍵酶APE-1 由細胞質向細胞核及線粒體轉位，以便有效清除DNA 氧化損傷，而過度的氧化損傷可能影響相關修復系統的正常功能，導致 DNA氧化損傷不能及時修復，加速衰老及相關疾病的發展．
3．2蛋白質的氧化損傷與堆積
蛋白質中半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸等對氧化還原比較敏感，成為 ROS/RNS 的主要作用靶點，發生多種形式的氧化修飾，一方面直接影響蛋白質的正常功能，另一方面，造成沒有功能的蛋白質堆積，導致細胞損傷和死亡．研究較早的是蛋白質羰基化修飾，不飽和醛反應或蛋白質自身氧化導致的蛋白質不可逆羰基化直接影響蛋白質折疊和降解.
從線蟲到人類，伴隨衰老羰基化蛋白質的水平是增加的．在過氧化亞硝基作用下蛋白質發生酪氨酸硝化，產生 3- 硝基酪氨酸\\(3-nitrotyrosine，3-NT\\)，也是一種不可逆的氧化損傷．蛋白質巰基不同程度的氧化及磺酸化都可能導致蛋白質堆積和細胞功能異常．研究發現衰老過程中蛋白質降解能力降低、多種酶的催化活性降低．此外，蛋白質氧化的另一個重要來源是脂質過氧化：不飽和脂肪酸受到活性氧和活性氮的攻擊產生反應活性高壽命長的脂類自由基以及不飽和醛類，進一步與蛋白質反應損傷細胞的功能．上述蛋白質的異常氧化修飾導致了蛋白質穩態異常，是衰老的重要標志之一．4延緩衰老和健康衰老的氧化還原調控新策略。
延緩衰老和健康衰老一直是人們追求的目標．鑒于氧化還原調控在衰老過程中的重要作用，提出以下幾個方面作為新的策略參考：
a．氧化還原平衡的維持．活性氧和活性氮的氧化還原調控是一個“雙刃劍”，一方面在有機體中廣泛參與細胞的信號轉導和生命過程，另一方面能造成生物大分子氧化損傷，影響大分子功能，從而導致衰老及相關疾病的發生．要保持細胞正常的生理功能，重要的是如何保持細胞內的氧化還原平衡，既不能有過度氧化損傷，也不能過度抗氧化而影響正常的氧化還原依賴的信號轉導，這在延緩衰老過程中同樣重要．
b．氧化還原平衡的系統調控．細胞的氧化還原狀態是一個系統調控，而不是單一哪一個指標就能代表的，比如，活性氧活性氮是經常檢測的氧化還原水平的指標，但生物大分子的氧化可能更有功能相關性．經典的氧化酶直接影響氧化還原活性物質的產生，但過渡金屬、環境的 pH 值和氧濃度等相關因子也會顯著影響細胞的氧化還原水平．小分子抗氧化看起來作用直接，但大分子抗氧化可能更有效率．因此，首要的問題是建立細胞氧化還原狀態的定量的系統描述，研究在衰老過程中這些不同參數的變化規律，進而在此基礎上系統調控機體的氧化還原平衡，否則，很可能顧此失彼 \\(圖 3\\)．【圖３】
c．氧化還原調控的個體化．衰老本身是一個個體化的事件，而每個人的氧化還原狀態也是各不相同，衰老過程的氧化還原變化因人而異，因此，衰老過程的氧化還原調控只有實現個體化才能真正對癥下藥．這方面的工作任重而道遠．5、結 語。
細胞的氧化還原平衡為胞內各種生物大分子行使正常功能提供了穩定的微環境，氧化還原狀態變化將直接影響蛋白質的功能，特別是氧化還原敏感的含巰基蛋白質的功能．因此，細胞氧化還原調控與衰老機制不再是簡單的“自由基衰老學說”，也不再是簡單的抗氧化延緩衰老，氧化還原活性小分子與生物大分子的交互作用\\(crosstalk\\)是揭示衰老機制的國際前沿，關鍵蛋白質的氧化還原修飾異?？赡苁撬ダ系闹匾獧C制．衰老過程中氧化還原平衡的維持、氧化還原相關基因的調控機制、氧化還原依賴的蛋白質巰基修飾與信號轉導、生物大分子氧化損傷的累積與清除、氧化還原平衡的系統調控及氧化還原狀態的個體化表征是細胞氧化還原研究的重要內容，將為揭示衰老機制提供重要依據，為延緩衰老和健康衰老提供新的策略．
