頭孢米諾鈉是第三代頭孢菌素藥物,由于其7-β側鏈的半胱氨酸能與肽聚糖結合發揮雙重抗菌作用,對格蘭氏陽性菌和格蘭氏陰性菌均有廣譜抗菌活性,同時還具有很強的抗厭氧菌活性,從而在臨床用藥上占據一定的優勢,被廣泛用于扁桃體、呼吸道、泌尿道、膽道、腹腔、子宮等部位感染,也可用于敗血癥的治療。目前頭孢米諾鈉的常規測定方法是高效液相色譜法\\(HPLC\\),也有荷移分光光度法及毛細管電泳法的報道。但尚未見到對其電化學性質的研究及電化學測定方法的報道。根據頭孢米諾鈉分子結構中具有羧基、羰基和氮、硫等雜原子,推測其在合適條件下應具有電化學活性,因此有必要研究頭孢米諾鈉的電化學性質,為其構效研究及有效檢測提供依據。利用電化學方法進行研究還可以獲得與藥物相關的動力學和熱力學參數,為進一步研究抗生素在人體內的藥代動力學過程,以及新抗生素類藥物的研制開發提供必要的理論依據。
本文研究了頭孢米諾鈉的電化學行為,探討了反應機制,進而建立了單掃描極譜法測定其含量的新方法。該方法操作簡便、測定快速、靈敏度高、抗干擾能力強。將擬定的方法已成功用于頭孢米諾鈉注射針劑及模擬血漿和尿液中含量的測定。
1、實驗部分
1.1儀器與試劑
MP-2型溶出分析儀\\(山東電訊七廠\\),三電極系統:滴汞電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑電極為輔助電極;pHS-3C型精密酸度計。頭孢米諾鈉\\(珠海聯邦制藥\\)標準儲備溶液:10.00g/L,使用時逐級稀釋至所需濃度。其他試劑均為分析純,實驗用水為蒸餾水。
1.2實驗方法
準確吸取一定量頭孢米諾鈉標準溶液于10mL容量瓶中,加入0.50mol/L磷酸溶液0.5mL,用水稀釋至10mL,搖勻,轉入電解池中,以起始電位-0.30V,終止電位-1.0V,掃描速率500mV/s進行陰極化掃描,記錄頭孢米諾鈉一階導數極譜圖及其所產生的極譜峰電流Ip。
1.3色譜測定
測定條件:Hypersil ODS2色譜柱\\(250×4.6mm,5μm\\),流動相為20mmol/L乙酸銨溶液\\(加冰乙酸調節pH至4.5\\)-甲醇-0.1%三乙胺\\(體積比85∶10∶5\\),流速為1.0mL/min,柱溫為25℃,檢測波長為254nm,進樣量10μL。
2、結果與討論
2.1頭孢米諾鈉電化學行為
2.1.1可逆性試驗
在磷酸底液中對濃度為200μg/mL的頭孢米諾鈉試液在-0.00 ~-l.00V電位范圍內進行循環伏安掃描并記錄其曲線,掃描過程的陽極支無氧化峰,在反掃描的過程中產生一個還原峰,說明電極反應是不可逆過程。
2.1.2吸附性
于底液中加入表面活性劑聚乙烯醇,觀察其對峰電流的影響。隨聚乙烯醇加入量的增多,峰電流不斷降低?？赡苁怯捎诒砻婊钚詣┖皖^孢米諾鈉在滴汞電極表面發生了競爭吸附,導致其峰電流下降。由此推測,還原波具有陽離子吸附的特性。綜上所述,頭孢米諾鈉的電極反應屬于不可逆吸附還原過程。
2.1.3電極反應電子數及電子轉移系數
掃描速率對峰電流IP和峰電位Ep均有影響。峰電流IP隨掃描速率v的增大呈線性變化,線性方程為:Ip=0.0311v-2.186,r=0.9985,進一步表明該電極過程主要受吸附控制。另外根據Laviron E理論,當體系為峰電流受吸附控制的不可逆體系時,其EP與掃速v的關系式為:
根據EP~lnv關系,Ep隨掃描速率的增加而負移,且峰電位EP與lnv在一定范圍內呈直線關系,Ep\\(V\\)=-0.0482lnv\\(mV/s\\)-0.4662,r=0.9978。與式\\(1\\)比較,斜率-RT/αnF=-0.0482,得αn=0.5337,因為:0.3<α<0.7,所以得n=1,α=0.53\\(25℃\\)。同樣與式\\(1\\)比較,截距E°-\\(RT/αnF\\)ln\\(αnF/RTks\\)=-0.4662。作EP~v關系曲線,用外推法可求得E°=-0.6693V。代入上式可求得反應速率常數ks=0.30s-1,ks較小,表明反應是不可逆的,與循環伏安法結果一致。
2.1.4電極反應質子數
pH在0.93~1.87范圍內,隨著pH增加,峰電位線性負移,表明電極反應有質子參加。實驗測得:Ep\\(V\\)=-0.0370pH-0.7032,r=0.9980。根據能斯特方程:Ep\\(V\\)=E°-0.059m/npH,由于n=1,求得m=0.63≈1,即參與電極反應的電子數和質子數均為1。
2.2單掃描極譜法測定頭孢米諾鈉方法的建立及分析應用
2.2.1底液的選擇
在-0.3~-1.0V范圍內,對濃度為200μg/mL頭孢米諾鈉進行線性掃描測定,沒有觀察到明顯的還原峰,加入不同介質并考察其電化學行為。通過對磷酸、鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、乙酸-乙酸鈉\\(pH 4.5\\)、磷酸鹽緩沖液\\(pH 8.35\\)、氯化鉀、氯化鈉、氫氧化鈉、氨水、氨水-氯化銨\\(pH 10\\)的考察,頭孢米諾鈉在磷酸、硫酸、鹽酸、硝酸、乙酸等酸性溶液中有較好的波形和較高的極譜峰電流;而基于電化學行為的探討,頭孢米諾鈉在溶液中電離失去Na+后,帶負電荷的頭孢米諾首先與H+結合\\(質子化過程\\),然后質子化的頭孢米諾鈉在滴汞陰極上還原析出\\(還原過程\\),所以酸性介質有助于頭孢米諾的質子化。在幾種酸性體系中,頭孢米諾鈉在磷酸介質中極譜峰最靈敏\\(圖1\\),因此,選擇磷酸作為測試底液。
2.2.2底液pH值的選擇
由于頭孢米諾首先要經歷一個質子化的過程,而且pH值對峰電流及峰電位均有影響,所以底液的pH值是一個重要的優化參數。結果表明:隨著底液pH值的減小,頭孢米諾鈉的峰電流逐漸增大;當pH值為1.35時,峰電流達到最大,隨后峰電流反而減弱。因此實驗選擇底液pH為1.35,極譜峰電流達到最大,波形穩定,此時磷酸的用量為0.5mL。
2.2.3穩定性及重現性
溶液配制好后立即測定和放置2h后測定,頭孢米諾的峰電流和峰電位基本不變,說明體系穩定性較好。按實驗方法對200μg/mL頭孢米諾鈉標準溶液進行8次測定,其峰電位恒定不變,峰電流值的相對標準偏差為1.31%。
2.2.4線性范圍和檢出限
在優化條件下,對頭孢米諾鈉標準系列溶液進行測定,頭孢米諾鈉質量濃度在10~650μg/mL范圍內與其峰電流\\(IP\\)呈線性關系:IP=0.0331c+0.9557,r=0.9995\\(n=10\\)。方法檢出限\\(S/N=3\\)為2μg/mL。
2.3樣品的測定
2.3.1頭孢米諾鈉針劑測定
取不同產地、不同批號的頭孢米諾鈉針劑各一支,用水溶解,轉移至1L容量瓶中。分別移取測試液各2mL,加0.5mol/L磷酸0.5mL定容到10mL,測定結果見表1。同時用高效液相色譜法\\(HPLC\\)進行對比實驗,所得結果一并列入表1。兩種分析方法的測定結果基本一致。同時進行了加標回收率試驗,回收率在93%~106%之間,符合中國藥典方法的要求。另外對針劑中常見輔料及可能的干擾物進行干擾試驗。在試驗條件下,對200μg/mL頭孢米諾標準溶液進行測定,當相對誤差在±5%時,50倍的苯甲酸鈉、糊精、葡萄糖、甘露醇、Na+、K+、Cl-,20倍的麥芽糖、Mg2+、Ca2+、Zn2+,1倍Cu2+不干擾測定。
2.3.2模擬血漿及尿液中頭孢米諾鈉的測定
在5個10mL容量瓶中,加入0.5mL健康人血漿及頭孢米諾鈉貯備液,加0.5mL磷酸,保持pH為1.35,配成含200μg/mL頭孢米諾鈉的模擬血漿溶液。另取5個10mL容量瓶中,加入1.0mL正常人尿樣及頭孢米諾鈉貯備液,配制成模擬尿樣,按標準加入法對含頭孢米諾鈉的模擬血漿、尿液進行回收率試驗\\(極譜圖見圖2\\),回收率結果在95.6%~102.3%之間,RSD為2.6%。由圖2可見,血漿及尿液中的內源性共存物不干擾頭孢米諾鈉的測定。
由上述分析結果可知,該方法可用于頭孢米諾鈉相關藥物的含量測定,并適用于臨床上頭孢米諾鈉血漿、尿液濃度的測定及藥代動力學研究。與測定同類項目的其他方法相比,溶出分析儀價格低廉;從所用的試劑材料看,只是普通的酸、堿、鹽;從分析周期看,測定速度快;尤其是樣品前處理簡單,對于血漿中樣品濃度的檢測,采用HPLC測定時,必需先經固相萃取等前處理步驟將血漿中蛋白質等干擾物去除,再經0.45μm濾膜過濾方可進樣,即便如此,共同進入色譜柱的雜質組份尚可對目標峰產生干擾。極譜法可對血漿樣品直接測定,還可以排除生物樣品分析中常遇到的混濁、黃疸、溶血等干擾。
3、結論
在磷酸底液\\(pH=1.35\\)中頭孢米諾與1個質子結合后在滴汞陰極獲得電子,產生不可逆吸附還原波。據此,建立了單掃描極譜法測定頭孢米諾鈉的新方法。該法具有操作簡便快速、儀器簡單低廉、準確度高、重現性好、選擇性高、抗干擾能力強等特點,適宜對不同樣品基質中頭孢米諾鈉含量進行測定。
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