脂肪酶\\( lipase，EC 3. 1. 1. 3\\) 主要是指一類能夠催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的酶，廣泛應用于水解或醇解、酯合成、酯交換、內酯合成、多肽合成、高聚物合成及立體異構體拆分等有機合成反應，是目前用途最廣泛的酶催化劑之一。豬胰脂肪酶\\( porcine pancreas lipase，PPL\\) 是一類重要的脂肪酶，在食品、化妝品、醫藥、洗滌劑和畜牧業等領域中均有廣泛應用。然而，PPL 的應用仍然存在一些不足，如一般具有實際應用價值的目標化合物并不是它的天然底物; PPL 活力不高，在有機溶劑、高溫、極端 pH 等非天然環境下極易失活等，這些不利因素限制了 PPL 在工業上進一步的廣泛應用。因此，對 PPL 進行分子改性以強化其催化性能，為工業應用提供活性更高、穩定性更好、環境耐受性更強的新酶品種，具有重要的實際應用價值。
化學修飾具有廉價、周期短、實驗室可行、容易創造新型的酶學性質等優點，是對脂肪酶進行分子改性的一種重要手段。雖然化學修飾 PPL 已經取得了一定的研究進展，但仍然局限于脂肪酸、氨基酸、酸酐、聚乙二醇\\( PEG\\) 和多糖等常用修飾劑的研究，修飾酶的催化活性、穩定性、耐有機溶劑性等性能往往不能同時得到有效的改善以滿足反應的需要。
離子液體近年來在生物催化領域的應用越來越廣泛，脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、醇氰酶、氧化還原酶等多種酶都在離子液體中顯示出了很好的穩定性。在離子液體中酶催化的區域、對映體選擇性往往都有所增加，尤其作為高極性底物的酶催化反應介質，離子液體顯示出了巨大的潛力。筆者所在課題組將功能化離子液體作為酶固定化載體材料 SBA-15 的表面修飾劑，結果表明修飾載體固定化的酶對溫度、pH 等的穩定性得到了有效提升，而且相對活力較游離酶有了較大提高。在固定化方法中，離子液體作為載體修飾劑。近幾年，Bekhonche 等首次提出了離子液體修飾酶的新型化學修飾方法，用含羥基的咪唑、吡咯等離子液體修飾甲酸脫氫酶，修飾酶的活性和穩定性得到了顯著提升。這些研究說明離子液體不僅可以作為反應介質用于酶催化反應中，還可以分別用作固定化載體及酶分子自身的修飾劑，目前還沒有其他用功能化離子液體修飾脂肪酶的報道。本文以 PPL為例，希望發展一種酶分子改造的新方法。
1 材料與方法
1. 1 藥品與試劑
PPL 購自 Sigma 公司并在 0 ～ 4 ℃ 下保存，酶的蛋白質含量為 9. 3%，以三乙酸甘油酯為底物時比酶活力為 362 U/g\\( 45 ℃、pH 7. 5\\) 。3 種離子液體氯化 1-羧甲基-3-甲基咪唑\\( 99%\\) 、氯化 1-羧甲基-3-乙基咪 唑 \\( 99% \\) 、氯 化 1-羧 甲 基-3-丁 基 咪 唑\\( 99%\\) 購自上海成捷化學有限公司。1-乙基-\\( 3-二甲基氨基丙基\\) 碳二亞胺\\( 98%\\) 、N-羥基琥珀酰亞胺\\( 98%\\) 、嗎啉乙磺酸\\( 97%\\) 購自阿拉丁試劑公司。其余試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。
1. 2 離子液體的活化
取 0. 001 mol 的離子液體，加入 0. 001 2 mol 1-乙基-\\( 3-二甲基氨基丙基\\) 碳二亞胺及 0. 111 5 molN-羥基琥珀酰亞胺，在 5 mL 的嗎啉乙磺酸溶液中，室溫攪拌反應 2 h 后停止。
1. 3 活化的離子液體修飾 PPL
取 2 g PPL 用去離子水溶解，向酶溶液中緩慢加入活化的離子液體，在 0 ～ 4 ℃ 下，磁力攪拌 6 h后，在去離子水中透析 24 h 備用。修飾度的測量通過三硝基苯磺酸法才測定。
1. 4 蛋白質含量測定
按照 Bradford的方法，以牛血清蛋白作為標準蛋白質繪制標準曲線。測定酶液的吸光值，根據標準曲線計算蛋白濃度。
1. 5 酶活的測定
1\\) 三乙酸甘油酯乳化液的制備 將 6. 83 g 三乙酸甘油酯在強力攪動下緩慢加入磷酸緩沖液\\( pH7. 0\\) ，得到三乙酸甘油酯乳化液，再加入磷酸鹽緩沖液定容至 100 mL。
2\\) 酶活測定 取 10 mL 上述制備的三乙酸甘油酯乳化液于100 mL 錐形瓶中，再加入15 mL 磷酸鹽緩沖液\\( pH 7. 5\\) ，于 50 ℃、150 r/min 下預熱 5min，然后向其中加入酶開始反應。反應 10 min 后取出，立即加入 15 mL 乙醇終止反應。用 0. 025mol / L 的 NaOH 溶液滴定，記錄 NaOH 的消耗量。
在一定條件下，每分鐘酶催化三乙酸甘油酯生成 1μmol 乙酸所需要的酶量，定義為一個酶活單位\\( U\\) 。
1. 6 最適溫度及最適 pH 的檢測
1\\) 最適溫度 調節反應緩沖液 pH 為 7. 0，分別在 30、35、40、45、50、55、60 和 65 ℃ 下水浴反應 10min，取出測定酶活。
2\\) 最適 pH 調節反應液的 pH 分別為 6. 0、6. 5、7. 0、7. 5 和 8. 0，50 ℃ 下水浴反應 10 min，取出測定酶活。
1. 7 酶的熱穩定性
將酶置于 50 ℃ 水浴中保溫，分別在 0、0. 5、1、2、4、6 和 8 h 取出，冷卻至室溫，再測定酶活。酶活測定方法同 1. 5。設保溫 0 h 時的游離酶的初始酶活為 100%。
1. 8 有機溶劑耐受性
在酶活測定的反應體系中，加入不同濃度的有機溶劑，測定修飾前后 PPL 在有機溶劑中的催化穩定性，設不含有機溶劑體系游離酶的初始酶活為 100%。
1. 9 紫外光譜測定
室溫下，取相同濃度的 PPL、PPL-M、PPL-E 和PPL-B 在紫外可見分光光度計上分別測定其紫外可見吸收光譜，測定范圍為 240 ～340 nm。
2 結果與討論
2. 1 水解活力的考察
表 1 為經修飾后的酶與 PPL 的表觀比酶活力的數據?！颈?】
由表 1 可知: 豬胰脂肪酶在經過修飾之后，活力有明顯的提高，說明離子液體修飾脂肪酶的方法有利于水解活力的提高。其中離子液體修飾的酶，隨著修飾度的增加活力增大，含短鏈的修飾有更好的水解活力，是游離酶的 1. 74 倍，而鄰苯二甲酸酐對PPL 的修飾只提高了 25% 的水解活力。隨著修飾劑的鏈長的增大，活力呈降低的趨勢。
2. 2 最適溫度的考察
根據經典酸堿滴定的方法，在不同溫度下考察酶水解三乙酸甘油酯特性，結果見圖 1。由圖 1 可知: 原酶最適反應溫度為 45 ℃左右; 經離子液體修飾后，PPL 的最適溫度向高溫方向移動至 55 ℃。與PPL 相比，修飾后的 PPL 對溫度的適應范圍更廣?！緢D1】
經過修飾后的酶對在高溫區相對游離酶更加趨于平緩，該點證明酶的離子液體修飾有助于提高溫度的耐受性。
2. 3 最適 pH 的考察
在不同 pH 條件下考察豬胰脂肪酶的三乙酸甘油酯水解特性，結果如圖 2 所示。由圖 2 可知: 修飾酶及游離酶的最適反應 pH 均為7. 5，修飾的 PPL 在6. 0 ～ 8. 0 之間對 pH 的敏感度明顯降低，離子液體的修飾拓寬了酶的使用范圍?！緢D2】
2. 4 熱穩定性的考察
熱穩定性是酶催化工業化應用的一個重要因素。圖 3 為酶的熱穩定性實驗結果。由圖 3 可知:
游離酶的熱穩定性較差，酶活下降快。在保溫 2 h后，酶活僅為初始酶活的 20%。PPL-M、PPL-E 及PPL-B 的熱穩定性均顯著提高; 在保溫 8 h 后，殘余酶活仍然保持在游離酶初始酶活的 60% 以上，尤其是長鏈的離子液體修飾的酶，酶活降低的更緩慢，熱穩定性更好?！緢D3】
2. 5 有機溶劑對酶活的影響
2. 5. 1 甲醇對酶活的影響
在 pH 7. 5、30 ℃不同甲醇體積分數的條件下，測定 PPL、PPL-M、PPL-E 及 PPL-B 的活力變化，結果見圖 4。
由圖 4 可知: 反應體系中加入不同體積分數的甲醇時，游離酶的相對活力一直在降低。而 3 種修飾酶的活力則是先升高，在高濃度的含甲醇體系中會下降，這可能是修飾后的酶在低濃度的甲醇中仍能維持構象穩定，而高濃度的甲醇會破壞部分氫鍵從而造成酶的解折疊。3 種酶的變化趨勢比較一致，且普遍高于 PPL，3 種修飾酶的活力大小順序\\( 從大到小\\) 為 PPL-M、PPL-E、PPL-B，但 PPL-B 的活力在含低濃度的甲醇中增加幅度高于其他 2 種修飾酶，在含高濃度的甲醇中的活力降低程度要低于其余 2 種修飾酶?！緢D4】
2. 5. 2 N，N-二甲基甲酰胺\\( DMF\\) 對酶活的影響
在 pH7. 5、30 ℃不同 DMF 體積分數的條件下，測定 PPL、PPL-M、PPL-E 及 PPL-B 的活力變化，結果見圖 5。
由圖 5 可知: 在反應體系中加入不同體積分數的 DMF 時，游離酶的活力一直在降低，而修飾酶均保持了較高的活力，在反應體系中存在 80%的 DMF 時，3 種修飾酶的活力仍然保持游離酶100 % 的相對活力以上。3 種修飾酶在不同濃度的 DMF 的反應體系中，酶活變化趨勢一致，修飾酶的 水 解 活 性 均 高 于 原 酶 PPL。在 含 低 濃 度DMF 中，PPL-M 的酶活高于其他 2 種修飾酶，在DMF 濃度不斷增加中，PPL-B 的活力受影響程度最弱，在 70% 以上的 DMF 體積分數中活力下降比例低于其他 2 種修飾酶，PPL 修飾后的耐 DMF的性能明顯提高?！緢D5】
2. 6 紫外光譜表征
圖 6 為脂肪酶 PPL、PPL-M、PPL-E 及 PPL-B 的紫外光譜變化圖。由圖 6 可知: PPL 經離子液體修飾后，紫外吸收光譜峰型未發生明顯變化，說明修飾后對 PPL 的空間結構沒有造成明顯的影響，但原270 nm 處的吸收峰發生輕微紅移，PPL-M、PPL-E 及PPL-B的最大吸收波長值分別為 271、272 及 275 nm，修飾酶的紫外吸光值均有所提高?！緢D6】
3 結 論
以 3 種陰離子的咪唑類離子液體對 PPL 進行化學修飾，修飾后的 PPL 水解活力明顯提升，修飾度越高，水解活力越高，且隨著修飾劑的鏈長的增大，活力呈降低的趨勢。與原酶相比，修飾酶的熱穩定、有機溶劑中的催化性能等酶學性質都得到了提高。
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