國家十二五規劃中明確提出: 增強新藥創制能力,加快單克隆抗體藥物的研究,重點開發治療惡性腫瘤的抗體藥物,突破生物技術藥物產業化的技術瓶頸,開發自主知識產權產品,搶占世界生物技術制藥的制高點.筆者主要總結了目前單克隆抗體藥物研發的一般流程,為發現、降低研發技術風險提供參考.
1背景與現狀
隨著當前工業化、城市化、老齡化進程的不斷推進,生態環境的惡化和生活壓力的不斷加大,惡性腫瘤的發病率越來越高.近20 年來我國癌癥有年輕化趨勢,發病率和死亡率"三線"不斷走高,每年新發腫瘤病例約為 312 萬例,平均發病率為 285. 91 /10萬,平均每分鐘有 6 人被診斷為惡性腫瘤.
惡性腫瘤的嚴重性導致腫瘤治療的需求不斷增加,抗腫瘤藥物的種類不斷增加,藥物市場迅猛發展.2007 年以來,抗腫瘤藥物一直是全球醫藥市場的領頭羊,目前全球流行的抗腫瘤藥物主要是生物藥物、靶向小分子藥、激素等.單克隆抗體\\(McAb,簡稱單抗\\) 技術又被稱為腫瘤"生物導彈",是能直接導向腫瘤的藥物[ 1 - 2 ].單抗抗腫瘤藥物以其良好的臨床效果和極佳的生物靶向性,穩居抗腫瘤藥物的前 3 位[ 3 ].2007 年至 2011 年全球抗腫瘤藥物銷售總額前 5 名中,利妥昔單抗 291. 65 億美元,貝伐單抗261. 3 億美元,曲妥珠單抗 247. 33 億美元,伊馬替尼 195. 88 億美元,亮丙瑞林 116. 89 億美元.可見,2007 年到 2011 年抗腫瘤藥物的銷售額巨大,排名前 3 位的都是以單抗技術制備的抗腫瘤藥物.2012 年,利妥昔單抗、曲妥珠單抗、貝伐單抗的銷售額分別達到了 56. 22 億、58. 89 億和 57. 64 億瑞士法郎,占其制藥公司藥品收入比重的 16% ,17% 和 16%[ 4 ].
單抗腫瘤藥物的市場需求巨大,形成鮮明對比的是,我國單抗抗腫瘤藥物研發能力的薄弱.單抗抗腫瘤藥物的研發壁壘高,我國單克隆藥物技術和國外先進水平有很大差距.單抗抗腫瘤藥物的巨大市場需求和國內現階段的技術發展水平,促使我們必須降低新藥的研發風險,增強單抗抗腫瘤藥物的研發能力.
2研發的一般流程及風險分析
2.1腫瘤靶點的發現和選擇
新藥的研發過程時間較長.據美國食品藥物管理局\\(FDA\\) 統計,一種新藥從研發到最后投入市場平均需要 12 年,其中實驗室研究階段需占用約 5 年時間[ 5 ].藥物靶標是新藥研發的基礎,單抗抗腫瘤藥物研發正是要找到相關腫瘤靶點,才能研制出針對腫瘤疾病的抗體藥物.單克隆抗體藥物出現的 30 多年來,針對抗腫瘤藥物的靶點,已經研制出多種單抗藥物.目前已發現的腫瘤靶點和腫瘤藥物如表 1 所示[ 6 - 8 ].對未知靶點研究的缺乏制約著單抗抗腫瘤新藥的研發,隨著以基因工程和分子生物學為代表的生物技術的發展,使針對靶點的高通量篩選成為可能,腫瘤靶點的研究不斷深入,靶點集中于細胞死亡通路、血管生成、細胞周期調控信號轉導等方面[ 9 ].目前國內單抗抗腫瘤藥物靶點的發現主要基于 3 個縱向層次的研究,即基因水平、轉錄水平和蛋白水平的靶點發現[ 10 ].
基因水平的單抗藥物靶標發現: 從基因庫中搜尋,人類基因組的不斷發展,擴大了新基因的篩選范圍,根據建立的基因數據庫,通過計算機模擬,就會增加藥物靶標發現的概率; 基因芯片技術,利用核酸雜交和堿基互補配對,用大量生物分子檢測樣品的遺傳信息,篩選藥物靶標[ 11 ]; 基因敲除技術,是指對 1 個結構已知而功能未知的基因,從分子水平上設計試驗,將該基因去除或用其序列相近的基因取代,然后從整體觀察實驗動物,推測相應基因的功能,發現藥物的相關靶點.
轉錄水平的單抗藥物靶標發現: 主要分為反義寡核苷酸技術和 RNA 干擾技術,對于單抗抗腫瘤藥物運用最廣泛的是 RNA 干擾技術.該技術能特異、高效地抑制基因表達,引起功能表型丟失,可以確定相應蛋白質功能,快速有效地鑒別藥物新靶點.
蛋白水平的單抗藥物靶標發現: 噬菌體展示技術,利用腫瘤外源蛋白或多肽與待篩選藥物的特異性親和作用,將特異性結合的外源蛋白或多肽的噬菌體大量富集,然后通過測序分析噬菌體表面展示的蛋白結構,發現可與藥物特異性結合的靶點; 蛋白芯片技術,是以蛋白質代替 DNA 作為檢測對象,測基因的表達和蛋白分子間的相互作用,以及協助尋找疾病診斷和治療的靶分子;三雜交系統,利用蛋白質間的相互作用,可檢測出與特定小分子作用的蛋白,從而發現腫瘤靶點.
目前靶點發現存在的困難可總結為以下幾個方面: 基因水平篩選的風險主要來自于基因技術發展還不成熟,對所有基因的作用不明了導致獲得靶點的效果不理想[ 10 ]; 轉錄水平篩選的風險主要來自 RNA 干擾技術,該技術在腫瘤細胞中轉染效率較低,動物體內和人體內結果的相似性有待考察,在特異性設計上還有較大難度[ 12 ]; 蛋白水平篩選風險來自噬菌體展示的容量大小,特異性檢測水平的程度以及篩選后蛋白功能具體測定的精確度[ 13 ].
2.2單抗抗腫瘤藥抗原制備
靶點明確之后,就可以進入抗原的制備階段.根據特異性的不同,腫瘤抗原可以分為腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原; 根據抗原種類的不同,可分為天然蛋白質抗原、基因重組抗原、合成性抗原和小分子半抗原.就抗體制備而言,天然抗原的效果最好,運用反復凍融法、超聲破碎法等直接從腫瘤標本中分離抗原; 基因重組抗原是指將目的基因插入載體,在原核或真核系統中表達,獲得相應抗原; 合成性抗原是根據蛋白的氨基酸序列,通過抗原表位分析找到抗原性好的多肽片段,通過固相合成制備抗原; 小分子半抗原分子量較小,免疫原性較弱,必須與載體連接之后才能產生免疫應答反應.
制備出的抗原,根據性質可分為顆粒型抗原和可溶性抗原,可溶性抗原要添加佐劑增強免疫原性.從純度上來說,雖然要求不高,但高純度的抗原能提高抗體獲得的可能性.目前純化抗原的定性鑒定的常用方法有親和層析法、雙向免疫擴散、免疫電泳及聚丙稀酞胺凝膠電泳等.純化蛋白質濃度的定量測定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法[ 14 ].
2.3抗腫瘤單克隆抗體制備
2. 3. 1雜交瘤技術
單克隆抗體制備的基本原理是,致敏的 B 淋巴細胞能分泌特異性抗體,但這些細胞不能在體外存活.骨髓瘤細胞可在體外大量繁殖的 HGPRT 缺陷株,但不能分泌特異性的抗體.將小鼠的骨髓瘤細胞與分泌某種抗體的 B 淋巴細胞融合,則融合的雜交瘤細胞既具有腫瘤細胞易繁殖的特性,又具有 B 淋巴細胞能分泌特異性抗體的能力.由于每個致敏的 B 淋巴細胞只針對單一的抗原決定簇產生抗體,所以克隆化的雜交瘤細胞能夠分泌針對單一抗原決定簇的單克隆抗體[ 15 ].國內雜交瘤技術生產抗體的技術相對較為成熟,主要包括動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選、目的抗體檢測、雜交瘤細胞的克隆化、雜交瘤細胞的凍存與復蘇、單抗的鑒定\\( 包括純化、效價測定、亞型測定、染色體數目檢測、特異性檢測、結合位點和親和力檢測\\) 等環節[ 16 - 17 ].
雜交瘤技術對于單抗藥物的研發有著劃時代的意義,但隨著研究的深入,其自身特點就為單抗抗腫瘤藥物的研發帶來了風險: 通過人腫瘤細胞免疫動物,不能產生足夠量的抗體,人和以小鼠為代表的實驗動物有很高的同源性,功能性蛋白易造成耐受狀態; 另一方面,人和動物的同源性還是有一定的區別,動物產生的抗體所帶有的免疫原性引起的 HAMA 反應又是人用藥所不能忽視的.
2. 3. 2抗體人源化技術
在基因工程快速發展之前,單克隆抗體的制備到雜交瘤細胞篩選出陽性克隆、檢測抗體親和力和特異性為終點.但嚴重的免疫原性制約了單抗抗腫瘤藥物的發展,基因工程的快速發展推動了抗體藥物的人源化改造,在鼠源抗體上進行人為改造并獲得成功.貝伐單抗、西妥昔單抗等都是通過人源化改造所得,在腫瘤臨床的效果和市場效益方面取得了巨大成功[ 18 ].抗體人源化改造包括 2 種,即嵌合抗體和改型抗體.
嵌合抗體: 是最先出現的人源化單克隆抗體,其可變區來自鼠單克隆抗體,恒定區來自人的單克隆抗體.國內普遍采用的技術是從制備好的雜交瘤分離出功能區基因,插入適當的表達載體中,獲得人源化嵌合抗體[ 19 ].一般用 PCR 方法將鼠源單抗 V 區基因克隆,與帶有人 CL 區和 CH 區的載體相拼接,構建嵌合抗體蛋白載體,將表達載體轉染到同一哺乳動物細胞內表達.嵌合抗體制備抗腫瘤藥物過程中的風險不能忽視,嵌合抗體保留的鼠抗體的可變區占整個抗體結構的 30% ,仍能引起較強的免疫原性,解決 HAMA 反應的效果并不理想,同時還引起了抗嵌合抗體反應\\(HACA\\)[ 20 ].這一風險直接制約了嵌合抗體技術研發抗腫瘤藥物的前景.此外,國內技術的不成熟會導致人源化抗體的特異親和力降低,抗體表達產量、表達載體的構建也是影響嵌合抗體成藥前景的風險因素.
改型抗體: 在嵌合抗體的制備過程中,又引進了重構抗體技術和表面重塑技術以提高抗體的人源化,形成人源化更高的改型抗體[ 21 ].改型抗體,又稱互補決定區\\(CDR \\) 移植抗體,是把鼠單抗的 CDR 移植到人單抗的骨架區\\(FR\\) 構建而成的抗體[ 22 ]; 這進一步降低了鼠單抗的異源性,僅有 9% 的序列來源于親本鼠單抗[ 23 ].抗體分子的可變區是由 CDR 和 FR 兩部分構成,VH 和 VL中各有 3 個 CDR 和 4 個 FR,VH 和 VL 上的 6 個 CDR 折疊成環狀,形成抗原結合位點,抗體的特異性和親和力主要由此區決定.
FR 的基本序列保守,在不同的抗體間具有較高的同源性,CDR 在序列和構象上的變異對 FR 構象影響較小,同一抗體的 FR 可適用于不同抗原結合位點的移植,抗體分子的上述結構特性提供了設計和構建改型抗體的物質基礎.改型抗體的免疫原性進一步降低,人源化達到了 90% ,但潛在的 10% 鼠源性仍有引起人體產生抗獨特型免疫反應的風險; 就國內技術而言,可選擇的人源 FR模板較少,且 FR 模板是不可以隨意替代的,CDR 移植后抗體與抗原的結合能力會減弱[ 24 ].這些都是改型單抗抗腫瘤藥物研發過程中不能忽略的風險因素.
2. 3. 3全人抗體制備技術
單克隆抗體的人源化改造確實降低了鼠源程度,但鼠源免疫原性仍然存在,同時人源化改造過程復雜、實驗周期長,獲得的抗體質量不穩定.20 世紀 90 年代以來,以噬菌體抗體庫技術為代表的全人抗體制備技術逐漸發展并不斷成熟,開拓了單抗抗腫瘤藥物研發的新思路.全人抗體的制備包括抗體庫技術和轉基因小鼠技術[ 25 ].通過全人抗體制備技術得到的抗體進行 ELISA 活性鑒定,酶切鑒定及可溶性表達,最終得到單克隆抗體[ 26 ].可以看出,全人抗體制備的關鍵風險因素,在于篩選技術的成熟與否、檢測水平的精確度、恰當技術的選擇.
1\\) 抗體庫技術噬菌體抗體庫技術: 是基于噬菌體展示技術發展起來的抗體庫技術,是一項基因重組的方法.將編碼外源基因的 DNA 片段利用基因工程的方法,導入到噬菌體載體上,將外源基因表達的蛋白與噬菌體蛋白融合,展示在子代噬菌體表面,一般得到抗原結合片段\\(Fab 片段\\) 或單鏈抗體\\(scFV\\) .噬菌體抗體庫除依靠噬菌體展示技術外,還依靠 PCR 技術和大腸桿菌分泌的有效免疫蛋白.
目前噬菌體抗體庫的構建方法是從人的淋巴細胞、腫瘤細胞通過PCR 方法提取總 RNA,反轉錄成 cDNA,構建文庫.王凈等[ 27 ]通過PCR 等方法構建成半合成、合成、天然或免疫的全人抗體庫,然后用已知抗原直接從全人抗體庫中通過親和篩選或全細胞篩選方法等得到與此抗原結合的噬菌體顆粒,再經歷一次體外融合,就能產生具有完整功能的全人抗體.但噬菌體抗體庫技術制備的抗體通常為 Fab 片段或 scFv 片段,由于沒有 Fc 片段而使親和力降低,受到外源基因的影響,導致轉化效率受到影響,這些是噬菌體抗體庫技術制備全人抗體的主要風險.
核糖體展示技術: 其基本原理是通過 PCR 擴增目的基因的DNA 文庫,同時加入啟動子、核糖體結合位點及莖環,并置于具有耦聯轉錄 /翻譯的無細胞翻譯系統中孵育,使目的基因的翻譯產物呈現在核糖體表面,并形成"mRNA - 蛋白質 - 核糖體"三元復合體,翻譯出來的抗體可用腫瘤抗原進行篩選,最后通過常規的免疫學檢測方法,通過固相化的靶分子直接從復合體中篩選出感興趣的核糖體復合體,再利用 RT - PCR 擴增,經過多次循環過程,最終篩選出高親和力的目標分子[ 27 ].但核糖體展示技術表達的蛋白質折疊和轉錄后修飾功能與目標所要的蛋白功能有沖突,故其所展示的抗體不能形成正確的三級結構,親和力往往較低,表達及純化難度大.
2\\) 轉基因小鼠技術其抗體生成過程是從鼠抗體生成基因被相應的人基因所取代的小鼠開始的.轉基因小鼠的 Ig 基因是用人的相應基因替代,產生對人免疫系統非異種抗體.這種影響人抗體的策略是改造小鼠的體液免疫系統,將人 Ig 基因微位點轉入小鼠,產生能分泌人Ig 的轉基因小鼠.利用鼠體體內親和力的成熟機制,一步即能產生一系列高親和力的全人單抗[ 28 - 29 ].理論上講,轉基因小鼠是目前生產全人單抗的最理想方法,但技術難度較大,國內并未獲得真正的突破.
2.4抗腫瘤單克隆抗體功能鑒定
獲得抗體之后,要進行抗體功能鑒定.特異性是指抗體選擇性地與某種或某類抗原結合的特性,親和力則是抗體結合部位與抗原決定簇的結合強度,抗體的特異性和親和力是鑒定抗體特性最重要的兩個指標[ 27 .單克隆抗體的靶向治療通過抗體依賴性細胞介導細胞毒性反應和補體依賴細胞毒性反應殺傷腫瘤細胞; 通過抗體競爭地與受體結合,干擾配體 - 受體的結合和相互作用,影響其發揮生物效應,抑制腫瘤生長; 抑制腫瘤新生血管形成,限制腫瘤的生長和轉移; 與受體結合直接誘導腫瘤細胞凋亡; 產生抗獨特型抗體,引起針對抗獨特型抗體的免疫應答等[ 15,26,30 ].提取腫瘤細胞,發現腫瘤表面相關標志物,采用酶聯免疫吸附試驗\\(ELISA\\) 、免疫組織化學\\(IHC\\) 、流式細胞學\\(FACS\\) 、免疫印跡雜交\\(Western blot\\)、免疫共沉淀等技術檢測[ 31 - 33 ]單克隆抗體特異性結合抗原的性質.通過臨床標本驗證和交叉反應測試,檢測抗體對腫瘤細胞的殺傷效果和不良反應.所有檢測過程都應符合要求后,才能進行抗體的大量生產.
3結語
從國內單抗抗腫瘤藥物的研發環節來看,主要分為靶點發現、靶點選擇、抗原制備、單克隆抗體制備技術的選擇以及抗體功能鑒定 5 個部分.其中靶點可以從基因水平、轉錄水平和蛋白水平 3 個方面發現和選擇,這 3 個方面的技術均存在各自的風險和缺陷; 單克隆抗體制備技術集中于雜交瘤技術、人源化技術和全人抗體制備技術,3 項技術各有利弊,目前哪種技術更具優勢還沒有共識.在各個環節中,可以通過不同環節的技術特點發現影響研發成果的風險因素,找到風險因素,并運用風險管理的思維和方法進行分析.由此,新藥研發管理者們就可以科學地避免或降低研發過程中技術風險帶來的損失,加快腫瘤抗體藥物的研發進度,盡早大力使新藥研發向中下游推進.
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