世界衛生組織\\(WHO\\)發布的流行病學數據顯示,甲型 H1N1 流感的易感人群、并發癥和重癥風險人群以年輕人及具有基礎性疾病的人群為主,尤以年輕人的發病率較高[1],而接種疫苗是預防甲型 H1N1流感流行的主要措施.
甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗系用 WHO 推薦,WHO 合作中心分發,并經國家藥品管理部門批準的甲型 H1N1 流感病毒株接種雞胚,經培養、收獲病毒液,濃縮、裂解和純化后制成,用于預防甲型 H1N1流感.作為裂解疫苗,其中血凝素含量對疫苗的免疫效果具有重要影響,而制品的保存條件和時間會影響血凝素含量的穩定.雖然甲流疫苗與普通流感疫苗的生產工藝流程相似[2-3],但作為新毒株及新制品,其免疫原性及質量仍需進一步觀察.為了考察制品的穩定性,保證疫苗的安全有效,本實驗進行了甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗的穩定性觀察,現將結果報道如下.
1 材料與方法
1. 1 疫苗 3 批甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗[規格為 15 μg /\\(0. 5 ml·瓶\\),批號分別為 20090701、20090704 和 20090707]和普通流感病毒裂解疫苗\\(作為對照疫苗,批號為 200907018,0. 5 ml / 瓶\\)均為本公司制備,含各型流感病毒株血凝素 15 μg.
1. 2 標準抗原 TGA\\(therapeutic goods administration\\)標準抗原購自澳大利亞治療用品管理局;NIBSC 標準抗原購自英國國家生物制品檢定所\\(NationalInstitutefor Biological Standards and Control\\).
1. 3 主要試劑 相應\\(亞\\)型流感病毒特異性免疫血清和抗體參考品均購自 NIBSC.
1. 4 熱穩定性試驗 根據課題組設計的甲型 H1N1流感病毒裂解疫苗 37 ℃熱穩定性試驗方案進行試驗:將 3 批甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗和對照疫苗于 37 ℃分別放置 0、3、7 d,對成品項目部分檢定或全部檢定.
1. 5 長期穩定性試驗 參照《中國藥典》二部\\(2005版\\)附錄ⅪⅩ C《原料藥與藥物制劑穩定性試驗指導原則》,設計甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗長期穩定性試驗方案:將 3 批甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗于 2 ~ 8 ℃分別放置 0、3、6、12、18 個月,對成品項目進行全部檢定;分別于放置 1、2、4、5、7、8、9、10、11、15 個月,進行部分項目檢定.檢測方法和質量標準參照《甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗注冊標準》.
1. 6 各項指標的檢測
1. 6. 1 鑒別試驗 用相應\\(亞\\)型流感病毒特異性免疫血清進行單向免疫擴散試驗,結果應證明抗原性與推薦病毒株相一致.
1. 6. 2 外觀檢測 應為輕微乳白色液體,無異物.
1. 6. 3 裝量檢測 按《中國藥典》三部\\(2010 版\\)附錄ⅠA 中裝量項進行,應不低于標示量.
1. 6. 4 pH 值檢測 按《中國藥典》三部\\(2010 版\\)附錄ⅤA 進行,應為 6. 8 ~ 7. 5.
1. 6. 5 游離甲醛含量檢測 按 《中國藥典》 三部\\(2010 版\\)附錄Ⅵ L 進行,應不高于 25 μg / ml.
1. 6. 6 血凝素含量檢測 將抗原參考品和成品分別加入含有抗體參考品的瓊脂糖凝膠板上,孔徑為2 ~ 4 mm,于 20 ~ 25 ℃擴散至少 18 h;PBS 浸泡 1 h后,干燥、染色、脫色.測量抗原參考品和成品形成的沉淀環直徑,以抗原參考品形成的沉淀環直徑對其相應抗原濃度進行直線回歸,得到直線回歸方程,代入成品的沉淀環直徑,即可得到血凝素含量.血凝素含量應為 24 ~ 36 μg / ml.
1. 6. 7 總蛋白質含量檢測 按《中國藥典》三部\\(2010版\\)附錄Ⅵ B第二法進行,應不高于 200 μg / ml,并不得超過疫苗中血凝素總含量的 5 倍.
1. 6. 8 卵清蛋白含量檢測 采用酶聯免疫法\\(仲裁方法\\)或對流免疫電泳法,應不高于 100 ng / ml.
1. 6. 9 無菌檢查 按《中國藥典》三部\\(2010 版\\)附錄Ⅻ A 進行,應符合規定.
1. 6. 10 異常毒性檢查 按《中國藥典》三部\\(2010版\\)附錄Ⅻ F 進行,應符合規定.
1. 6. 11 細菌內毒素檢查 按《中國藥典》三部\\(2010版\\)附錄Ⅻ E 凝膠限量試驗,應小于 40 EU / ml.
1. 6. 12 硫柳汞含量檢測 應為 85 μg / ml ± 15%.
2 結 果
2. 1 熱穩定性 檢測結果顯示,3 批甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗于 37 ℃放置 7 d,鑒別試驗、外觀、裝量、無菌檢查和異常毒性檢查結果均合格,其他各項指標均符合甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗制造和檢定規程要求,且與 0 d 結果比較無明顯差異,見表1.對照疫苗于 37 ℃放置 7 d,各項指標檢查結果均合格,均符合流感病毒裂解疫苗制造和檢定規程要求,且與 0 d 結果比較無明顯差異,見表 2.
2. 2 長期穩定性 檢測結果顯示,3 批甲型 H1N1流感病毒裂解疫苗于 2 ~ 8 ℃放置 18 個月,鑒別試驗、外觀、裝量、pH、硫柳汞含量、無菌檢查、異常毒性檢查、細菌內毒素含量、卵清蛋白含量均合格,均符合甲型 H1N1 流感病毒裂解疫苗制造和檢定規程要求,且與 0 月結果比較無明顯差異;血凝素含量也較穩定,與 0 月相比,無明顯差異,均在正常范圍\\(12 ~ 18 μg / 0. 5 ml\\)內.見圖 1.
3 討 論
流感病毒屬于正黏病毒科[4],病毒體為多形性結構,核衣殼為螺旋對稱,病毒表面的包膜上含有血凝素和神經氨酸酶.血凝素是一類蛋白質,病毒依靠血凝素與宿主細胞結合,因此其為流感病毒最主要的表面抗原,能誘導機體產生相應的中和抗體以中和病毒,具有保護作用.血凝素抗體為中和抗體,因此,抵抗感染的發生與血凝素抗體有關,且疫苗血凝素的含量是影響免疫接種效果的重要因素.血凝素含量是考核疫苗質量的關鍵指標,血凝素的穩定對疫苗的穩定性十分重要.疫苗血凝素含量較高,并在效期內相對穩定,才能保證疫苗具有良好的免疫原性.由于流感疫苗主要以血凝素含量作為效力指標,因此,血凝效價的測定是評估疫苗質量最客觀、可和和重要的指標.
本實驗觀察的疫苗系經病毒培養、濃縮、第 1 次純化、病毒裂解、第 2 次純化等工藝制成.純化保留了病毒中核蛋白和膜蛋白等內部抗原、血凝素和神經氨酸酶表面抗原等有效成分,去除了具有反應原性的病毒類脂質部分,降低了疫苗的接種副反應,并保持相對較高的免疫原性,為一種理想的流感疫苗,經臨床試驗證實,具有良好的安全性和有效性\\(尚未發表\\).本實驗觀察了該疫苗的穩定性,結果表明,甲型H1N1 流感病毒裂解疫苗熱穩定性和長期穩定性均良好,在 2 ~ 8 ℃儲存條件下,疫苗的效期可定為 12個月.2010 年版《美國藥典》\\(32 版\\)收載了流感疫苗,并將有效期定為 1 年[5 ].本公司研制的甲型H1N1 流感病毒裂解疫苗質量穩定,達到了發達國家藥典的要求.
參考文獻
[1] 尉嵐,高虹. 甲型 H1N1 流感危害與疫苗政策簡介[J]. 中國預防醫學雜志,2010\\(6\\):648-649.
[2] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of People′sRepublic of China\\(Vol Ⅲ\\)[S]. Beijing:China Med Sci Press,2010:162-164.\\(in Chinese\\)國家藥典委員會. 中國藥典\\(三部\\)[S]. 北京:中國醫藥科技出版社,2010:162-164.
[3] 國家食品藥品監督管理局. 流感病毒裂解疫苗藥品注冊標準[S]. WS4\\(-ZB-002\\)2011. 2011-06-01.
[4] Zhao K,Zhang YH,Li HM. Medical Biology[M]. Zn ed. Bei-jing:People′s Medical Publishing House,2007:805-816\\(.inChinese\\)趙鎧,章以浩,李河民. 醫學生物制品學[M]. 2 版. 北京:人民衛生出版社,2007:805-816.
[5] The United States Pharmacopeial Convention. U. S. Pharmarcopoeia 33[S]. Rockville,MD:Board of Trustees,2010:1132.
