哮喘是一種免疫調節異常的呼吸系統疾病,其發病機制復雜.免疫反應異常是哮喘發生的重要環節,在哮喘中發揮關鍵作用[1].本課題前期構建了熱休克蛋白 70 \\( heat shock protein70,HSP70\\) /CD80 DNA 疫苗,以該重組融合蛋白作為免疫原,刺激機體產生免疫應答.并觀察 HSP70/CD80DNA 疫苗對小鼠急慢性哮喘的預防和治療作用,發現其機制可能是從非特異性免疫方面恢復輔助性 T細胞 1 \\( T helper cell 1,Th1\\) /輔助性 T 細胞 2\\(T helper cell 2,Th2\\)平衡[2-3].隨著人們對 CD4 +T 細胞認識的逐漸深入,發現 CD4 + CD25 + 調節性T 細胞\\( regulatory T cell,Treg\\) 和輔助性 T 細胞 17\\(T helper cell 17,Th17\\)也在哮喘的發生中具有重要作用.HSP70/CD80 DNA 疫苗在治療哮喘的過程中是否也調節 Treg /Th17 的平衡,目前尚不清楚.

本研究擬探討 HSP70/CD80 DNA 疫苗治療小鼠急性哮喘的作用及其對 Th1/Th2/Treg /Th17 的影響,旨在為該疫苗的臨床應用提供實驗基礎.

1 材料與方法

1. 1 材料 健康雌性、SPF 級近交系 BALB / c 小鼠購于第三軍醫大學; HSP70/CD80 DNA 質粒由瀘州醫學院附屬醫院感染與免疫實驗室構建[4];End-ofree 質粒大量提取試劑盒購于德國 QIAGE 公司;離心柱式總 RNA 提取試劑盒購于天根生化科技\\(北京\\)有限公司;iScriptTMcDNA Synthesis Kit 購自美國 Bio-Rad 公司;TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII 購自寶生物工程\\( 大連\\) 有限公司;Real-time PCR引物由寶生物工程\\(大連\\)有限公司合成.

1. 2 方法1. 2. 1 疫苗制備 pVAX1 \\( +\\) 質粒和 HSP70 /CD80 DNA 質粒的制備按照試劑盒說明書進行.測定純度及濃度后,用生理鹽水調整濃度到1 mg/mL備用,-20 ℃存儲.

1. 2. 2 動物模型制備 BALB / c 小鼠隨機分為 4組:空白對照組\\(空白組\\),哮喘模型組\\(模型組\\),pVAX1\\(+\\) 空載體對照組\\( 空載組\\) 和 HSP70 / CD80疫苗治療組\\(治療組\\),每組 10 只.模型制備過程中,空載組死亡 1 只小鼠.實驗開始第 0 和 14 天,新鮮配制含 10 μg 雞卵清蛋白\\(ovalbumin,OVA\\)的鋁佐劑混懸物 200 μL,分別腹腔注射模型組、空載組和治療組小鼠,而空白組小鼠注射等劑量生理鹽水.第 17 和 25 天,治療組小鼠股四頭肌處肌內注射 100 μg HSP70/CD80 DNA 疫苗,空載組注射100 μg pVAX1,空白組和模型組注射等體積生理鹽水.第 28 天,對模型組、空載組和治療組小鼠以1% OVA 行霧化吸入激發,連續 7 次,30 min / 次.空白組生理鹽水霧化.

1. 2. 3 氣道反應性檢測 最后一次 OVA 霧化 24 h內,吸入乙酰甲膽堿\\(methacholine,Mch\\)后檢測小鼠肺功能,全身體積描記儀記錄 Penh,按以下公式計算出%基線 Penh 值:100 × \\(檢測 Penh 值 - 基線Penh 值\\) / 基線 Penh 值,各組進行比較.

1. 2. 4 ELISA 法檢測血清 IgE 取小鼠眼球血,4 000 r / min離心 10 min,收集血清,- 80 ℃ 保存.

1. 2. 5 觀察肺組織病理學改變 切取肺組織固定于4%多聚甲醛12 h.制備切片,進行 HE 和AB-PAS染色.鏡下觀察炎細胞浸潤、杯狀細胞增生分泌情況,參照文獻對炎細胞浸潤和杯狀細胞進行評分[5-6].

1. 2. 6 ELISA 法檢測氣管肺泡灌洗液\\( bronchoal-veolar lavage fluid,BALF\\)中細胞因子含量 注入400 μL 生理鹽水到主支氣管,反復灌洗 3 次,吸出BALF,2 000 r / min 離心 10 min,收集上清,檢測 γ-干擾素\\(interferon-γ,IFN-γ\\)、白細胞介素-4\\(inter-leukin-4,IL 4\\)、轉 化 生 長 因 子 β \\( ransforminggrow th factor beta,TGF-β\\)和白細胞介素-17\\(inter-leukin-17,IL 17\\)含量.

1. 2. 7 檢測肺組織中轉錄因子 mRNA 水平 按試劑盒說明書進行肺組織總 RNA 提取、逆轉錄和Real-time PCR 反應.檢測各樣本 T-bet、GATA 連接蛋白 3\\(GATA binding protein 3,GATA3\\)、叉頭蛋白 3\\(forkheah box protein3,Foxp3\\)和維甲酸受體相關孤兒受體 \\( retinoid related orphan receptorgamma t,RORγt\\) Ct 值.根據 Ct 值,用軟件 ABIStepOne 進行分析,按公式 2- △△CT計算各樣本相對表達量.

1. 3 統計學處理 采用 SPSS 17. 0 軟件.先用Shapiro-Wilk 行正態分布檢驗,符合正態分布即可用方差分析行多組間比較,用 LSD 檢驗行多組間兩兩比較,數據以x± s 表示.如不符合用 Kruskal-Wallis H 檢驗行多組間比較,用 Mann-Whitney U 檢驗行多組間兩兩比較,數據以 M\\(P25,P75\\) 表示.P < 0. 05 為差異有統計學意義.

2 結 果

2. 1 氣道反應性的改變 見表 1.Mch 吸入濃度達到 24 mg /mL 后,與空白組小鼠相比,模型組和空載組小鼠氣道反應性升高 \\(P <0. 05\\);與模型組小鼠相比,治療組小鼠氣道反應性降低\\(P <0. 05\\).

2. 2 IgE 水平的變化 模型組和空載組的血清 IgE濃度[\\(7.45 ±0.81\\) pg/mL,\\(7. 08 ±0. 74\\) pg/mL]高于空白組[\\(5. 36 ±0. 29\\) pg /mL],P <0. 05;治療組的血清 IgE 濃度[\\(5. 91 ±0. 52\\) pg /mL]低于模型組和空載組\\(P <0. 05\\).

2. 3 肺組織炎細胞浸潤和黏液分泌情況 見表 2、圖 1.與空白組相比,模型組和空載組小鼠肺組織出現大量炎細胞浸潤\\(P <0. 05\\),以單核細胞和嗜酸粒細胞為主;與模型組和空載組相比,治療組小鼠的氣道、血管周圍和肺泡區炎癥反應減輕 \\(P <0. 05\\) .AB-PAS 染色后進行杯狀細胞評分,結果表明,模型組和空載組小鼠的支氣管上皮中陽性杯狀細胞增多\\(P <0. 05\\);與模型組相比,空白組和治療組小鼠杯狀細胞增生不明顯\\(P <0. 05\\).

2. 4 細胞因子的改變 見表 3.計算 BALF 上清液中細胞因子 IFN-γ/IL-4 和 TGF-β/IL-17 比值,結果表明,模型組的比值低于空白組和治療組比值\\(P <0. 05\\).

2. 5 轉錄因子表達水平 見表 3.計算 T-bet / GA-TA-3 比值和 Foxp3 / RORγt 比值,結果表明,模型組比值低于空白組和治療組比值\\(P <0. 05\\).

3 討 論

哮喘以氣道高反應性、氣道炎癥和氣道重建為主要特征.本研究用 OVA 致敏激發小鼠,末次霧化激發后小鼠出現上述典型癥狀,說明模型成功建立.HSP70 是一類以分子伴侶形式維持細胞穩態的高度保守的蛋白.HSP70 可以通過干擾細胞內炎癥信號轉導通路而抑制炎癥反應[7].在哮喘的炎癥反應中,HSP70 與樹突細胞、單核細胞和髓系衍生抑制性細胞表面受體相結合,從而使這些細胞免疫應答活化.HSP70 還可增強 Treg 細胞因子IL-10和 TGF-β 的分泌[8].CD80 是免疫球蛋白超家族成員,常表達于 DCs、B 細胞、巨噬細胞等細胞表面.研究表明,CD80 通過與 T 細胞表面分子CD28 和 / 或 CTLA-4 作用,為 Treg[9]、Th17[10]等 T淋巴 細 胞 活 化 提 供 共 刺 激 信 號.HSP70/CD80DNA 疫苗對急性哮喘小鼠進行干預后,發現哮喘氣道癥狀有所減輕,提示該疫苗可能對其有治療作用.

Th1 / Th2 失衡是哮喘發病的核心.Th2 活化過程中,轉錄因子 GATA-3 和 T-bet 發揮重要作用[11].T-bet 是調節 Th1 分化的關鍵轉錄因子,它能抑制IL-4 的合成[12]和 Th2 的活化[13].哮喘時 Th2 增強,Th1 抑制,Th1/Th2 平衡向 Th2 發生偏移.本研究用 HSP70/CD80 DNA 疫苗治療哮喘小鼠后,發現治療組 IFN-γ/IL-4 比值和 T-bet/GATA-3 比值相較模型組升高,IFN-γ 和 T-bet 也升高,說明該 DNA疫苗上調 IFN-γ/IL-4、T-bet/GATA-3,可能通過改變 Th1/Th2 失衡狀態,從而發揮對哮喘的治療作用.

Treg 細胞能夠抑制哮喘反應的發生.Treg 細胞分泌 TGF-β、IL-10 等細胞因子,抑制嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞的活化,減輕 Th2 細胞因子 IL-9 等的分泌,從而抑制氣道炎癥反應.

Th17 細胞能夠促進哮喘反應的發生.Th17 細胞合成、分泌細胞因子 IL-17,IL-17 具有活化支氣管上皮細胞的作用,使其分泌多種促炎因子,從而加重氣道炎癥反應[14-15].Treg 和 Th17 細胞相互制約,維持平衡.轉錄因子 RORγt 和 STAT3 調控 Th17 細胞的活化.Treg 分化由關鍵轉錄因子 Foxp3 調節和信號轉導通路 TGF-β/Smad 調控.本研究結果顯示,模型組 TGF-β/IL-17 比值和 Foxp3/RORγt 比值降低,同時 Foxp3 降低、RORγt 升高,提示免疫平衡向Th17 發生偏移.通過疫苗治療后,降低的 TGF-β /IL-17 比值和 Foxp3 / RORγt 比值回升,TGF-β 和Foxp3 也升高,說明 HSP70 / CD80 DNA 疫苗可能通過改變 Treg /Th17 平衡,而在哮喘的治療中發揮作用.

Th1 / Th2 / Treg / Th17 細胞間并非是靜止不變的,而是保持著一種動態平衡關系.與以往的研究結果一致,本研究發現 Th2、Th17 的促炎反應與Th1、Treg 的抑制炎癥之間存在相互協同、相互抑制的作用.HSP70/CD80 DNA 疫苗除了通過 IFN-γ/IL-4 和 T-bet / GATA-3 比值的上調,以恢復 Th1 /Th2 平 衡 外,還 能 上 調 TGF-β / IL-17 和 Foxp3 /RORγ 比值,從而恢復 Treg / Th17 平衡,最終緩解哮喘的各種氣道癥狀,對其產生治療作用.

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