摘要\\(詳見正文\\)

一 發展簡史

1.1開始

1.2 發展

二 研究現狀

2.1 細胞融合

2.2 細胞核移植

2.3 轉基因動物

2.4 動物細胞培養

三 制造實例

3.1 類淋巴細胞干擾素

3.2組織型纖溶酶原激活劑

3.3尿激酶原

3.4促紅細胞生成素

3.5凝血因子Ⅷ

3.6乙型肝炎疫苗

四展望

參考文獻

以下是論文正文

摘 要

動物細胞工程制藥是動物細胞工程技術在制藥行業方面的應用.當前動物細胞工程所涉及的主要技術領域包括細胞融合技術、細胞器特別是細胞核移植技術、染色體改造技術、轉基因動植物技術和細胞大量培養技術等方面 [1].本文綜合論述了動物細胞工程制藥的發展簡史,研究近況和制造實例,并在此基礎上探討了動物細胞工程制藥的未來發展趨勢和前景.

關鍵詞:動物細胞工程制藥 細胞融合 細胞大規模培養 核移植

21世紀,生物技術制藥是制藥行業的亮點,近25年來,世界生物技術工業飛速發展,創造了35種重要的治療性生物技術藥物.中國生物技術產業是緊跟世界產業同步發展的.2007年全球生物技術藥物市場銷售額已達到828億美元.基因工程、細胞工程和酶工程組成三駕馬車行駛在現代生物技術發展大道的前列.動物細胞工程在生物制藥的研究和應用中起關鍵作用,目前全世界生物技術藥物中使用動物細胞工程生產的已超過80%,例如蛋白質、單克隆抗體、疫苗等.所以對動物細胞工程制藥的研究具有重要意義.

一 發展簡史

1.1開始

疫苗是動物細胞技術的開始,在疫苗產業早期,往往利用動物來生產疫苗,如用家兔人工感染狂犬病毒生產狂犬疫苗,用奶牛來生產天花疫苗,用某些細菌接種到動物身上來生產抵抗該種細菌的疫苗.在1920年至1950年,已經開發了多種病毒或細菌疫苗,如傷寒疫苗、肺結核疫苗、破傷風疫苗、霍亂疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗和黃熱病疫苗等.早在1950年代,已經能夠利用動物細胞培養技術來生產病毒.先在反應器中大規模培養動物細胞,待細胞長到一定密度后,接種病毒,病毒利用培養的細胞進行復制,從而生產大量的病毒,這一突破是動物細胞技術或細胞工程的真正開始.基于動物細胞技術生產的病毒疫苗包括減毒的活病毒,或是滅活的病毒.在過去的30多年時間內,用動物細胞技術生產的疫苗挽救了幾百萬人和動物的生命.1950年至1985年期間, 細胞工程及其他技術的進步,生產了多種人用疫苗來預防脊髓灰質炎、麻疹、腮腺炎、風疹、乙肝和帶狀皰疹等,并用于生產多種獸用疫苗[2].但是,這段時期對細胞表達水平的研究仍然很低,因而用這種工藝生產蛋白制品產量低、成本高,因此早期的動物細胞技術只用于疫苗及少量的干擾素和尿激酶的生產.

1.2 發展

1970年代的兩項劃時代的科學發現基因重組技術和雜交瘤技術大大促進了動物細胞技術的進步以及在工業領域的應用,使得動物細胞大規模培養技術在生產疫苗,尤其在生產天然的用于診斷和治療疾病的生物制品中具有舉足輕重的作用.動物細胞技術還用于生產許多診斷和治療疾病的單克隆抗體.用于生化檢測的單抗有幾千種,而單抗用于人體疾病治療是近幾年來生物制藥的一個重要領域,有幾十種單抗藥物正處于臨床試驗中.從1986年FDA批準第一種單抗治療藥物用于器官移植治療、可以抑制排斥反應的抗CD3單克隆抗體OK-T3以來,已有9種治療用單抗藥物獲得FDA批準.另外,許多將病毒的抗原決定簇基因轉染到宿主細胞體內,用于生產安全性更高、療效更好的基因工程疫苗也正在開發之中.

二 研究現狀

動物細胞工程制藥主要涉及細胞融合技術、細胞器移植尤其是核移植技術、染色體改造技術、轉基因技術和細胞大規模培養技術等.

2.1 細胞融合

是用自然或人工的方法使兩個或幾個不同細胞融合為一個細胞的過程.可用于產生新的物種或品系及產生單克隆抗體等.在我國目前動物細胞工程的發展中,技術最成熟的當數細胞融合.其中淋巴細胞雜交瘤在國內已普遍開展,并培育了許多具有很高實用價值的雜交瘤細胞株系,它們能分泌產生在診斷和治療病癥方面發揮重要作用的單克隆抗體.如甲肝病毒單克隆抗體[3]、抗人Ig M單克隆抗體[4]、腫瘤疫苗[5]等可用于治療疾病;抗人結腸癌雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體[6],巨噬細胞集落刺激因子受體\\)胞外區的單克隆抗體等[7]則對診斷疾病具有重要價值.由于技術已趨成熟,目前許多單克隆抗體已經進入產業化的生產階段.

2.2 細胞核移植

細胞核移植就是將一個動物的細胞核, 移植到卵細胞中,并發育生長.核移植技術可用于具有良好發展前景的生物反應器的制備.其中乳腺生物反應器的研制是最為看好的一個轉基因制藥方向.利用轉基因動物乳腺作為生物反應器,生產基因工程人類蛋白質藥物[8],其成本較微生物發酵、動物細胞培養生產基因工程藥物大大降低.但十幾年來, 顯微注射技術一直是生產乳腺生物反應器的唯一實用手段, 由于它本身固有的缺點,使得乳腺生物反應器未能有長足的步.基因打靶與核移植相結合很可能成為生產乳腺生物反應器更有效的途徑,它在外源基因定點整合、 消除位點效應、降低生產成本、 節省時間方面具有明顯的優勢.

核移植技術在我國特別是培育魚類新品種方面已有多年的研究基礎.目前我國在哺乳動物細胞核移植方面的研究也開展得很好,除了傳統的胚胎細胞核移植外[9],體細胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物種上均獲得了成功.如2000年6月,西北農林科技大學先后培育出了世界上第一只成年體細胞克隆山羊"元元"和第二只成年體細胞克隆山羊"陽陽"[10].另外,在利用轉基因動物作為生物反應器生產基因工程藥物方面,上海人類遺傳病研究所、中國農業大學、中國科學院發育所、揚州大學、新疆畜牧科學院、解放軍軍事醫學科學院和解放軍軍需大學等都先后獲得了可能有潛在生產人用藥物蛋白價值的轉基因動物.

2.3 轉基因動物

轉基因動物是指經人的有意干涉,通過實驗手段將外源基因導入動物細胞中并穩定地整合到動物基因組中,且能遺傳給子代的動物.讓動物成為制藥工廠、創造人類急需的生物制品,這一直是人們夢寐以求的.轉基因動物的出現使得這一夢想正逐步成為現實.在21世紀制藥工業中,最具誘人前景的無疑是應用轉基因動物生產轉基因藥物.轉基因動物生產藥物與以往的制藥技術相比,具有不可比擬的優越性.哺乳動物生物反應器好比在動物身上建藥廠.動物的乳汁或者血液可以源源不斷地為我們提供目的基因的產品.它的優越性還表現在產量高,易提純,表達產物已經過充分修飾和加工,具有穩定的生物活性.另外,作為生物反應器的轉基因動物又可無限繁殖,故具有投資成本低、藥物開發周期短和經濟效益高等優點.可以說轉基因動物的問世,為利用基因工程手段獲得低成本、高活性和高表達的藥物開辟了一條重要途徑.

作為生物反應器的轉基因動物,主要是利用其乳腺組織和血液組織進行定位表達,特別是用乳腺組織生產具有生物活性的多肽藥物和具有特殊營養意義的蛋白質,已成為一個新興的轉基因制藥業.至今已在以下動物的乳汁中生產出一些人類蛋白質藥物:牛奶中有抗凝血酶、纖維蛋白原、人血清白蛋白、膠原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基轉移酶、蛋白C等,山羊奶中有抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、組織型纖維溶原激活因子、單克隆抗體,綿羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纖維蛋白原、蛋白質C,豬奶中亦有蛋白質C、凝血因子IX、纖維蛋白原、血紅蛋白等[11].我國在這方面的研究也很活躍,并取得了一些成果.早在1996年黃淑幀等成功制備了5頭有目的基因\\(人凝血因子IX基因\\)整合的轉基因羊\\(3公2母\\),其中1頭母羊已于1997年9月產下小羊羔,進入泌乳期,其乳汁中含有活性的人凝血因子IX蛋白,這種凝血因子是治療血友病的珍貴藥物[12].而近幾年來的轉基因產物更是如雨后春筍般的涌現出來,如潘玲、黃俊成和黃英等,分別在轉基因小鼠乳汁中成功地表達了人促紅細胞生成素、人胰島素原和人血清白蛋白.

轉基因動物除了可在生產基因工程藥物方面發揮重要作用外,還可用于建立診斷和治療人類疾病的動物模型、生產可用于人體器官移植的動物器官等方面.863高科技展覽中展示的長有"人耳"的小鼠顯示了這方面的良好前景,這將有效地解決器官異體移植的生理適應難度大的問題和大幅度地降低器官異體移植的成本.

2.4 動物細胞培養

動物細胞培養是指離散的動物活細胞在體外人工條件下的生長、增殖的過程.動物細胞培養開始于本世紀初.1962年,其規模開始擴大,發展至今已成為生物、醫學研究和應用中廣泛采用的技術方法,利用動物細胞培養生產具有重要醫用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等,已成為醫藥生物高技術產業的重要部分[13].

利用動物細胞培養技術生產的生物制品已占世界生物高技術產品市場份額的50%[14].大量資料表明,生物技術藥物是當前新藥開發的重要領域,生物技術制藥工業是下一個10年制藥工業的重要新門類,期間將有數百種生物技術新藥上市[15].動物細胞大規模培養技術是生物技術制藥中非常重要的環節.目前,動物細胞大規模培養技術水平的提高主要集中在培養規模的進一步擴大、優化細胞培養環境、改變細胞特性、提高產品的產率與保證其質量上[16].

三 制造實例

如今,利用動物細胞生產的生物制品已日益增多.美國自1996年以來批準的33個產品中有25個是用動物細胞生產的.下面就幾個在動物細胞工程制藥的發展史上具有重要意義的產品進行介紹.

3.1 類淋巴細胞干擾素

類淋巴細胞干擾素是由一株從Burkitt淋巴瘤的患者獲取Namalva細胞生產的干擾素,它含80%左右的IFN-α,20%左右的IFN-β.該干擾素首先由英國的Wellcome公司的Fante和Finter等開發成功,并擴大至8000L罐生產.該產品1986年先在英國獲準進入市場,商品名為"Wellferon".1999年Wellferon獲美國FDA批準進入美國.該干擾素獲準生產在動物細胞發展技術史上是一個很重要的里程碑,因為這是第一個獲準用腫瘤細胞系生產的人用藥品.

類淋巴細胞干擾素的生產工藝大致如下:先將細胞逐級放大直至4000L或8000L罐,培養基用RPMI1640培養基,加10%小牛血清.培養方式主要是攪拌式批次培養,當細胞密度達1×106/ml時,加入2nmol/L丁酸鈉起動48h,接著用仙臺病毒\\(50HAU/ml\\)誘生,18h后冷卻至5~10 ℃,收集培養液,連續離心分離細胞,對上清液進行分離純化.類淋巴細胞干擾素已被廣泛應用于臨床治療多種病毒性疾病,如乙型肝炎、丙型肝炎,以及多種腫瘤病的治療,如毛細血管白血病、Kaposi肉瘤等.

3.2 組織型纖溶酶原激活劑

據不完全統計,各種血栓病已成為許多國家人口死亡和致殘的第一位原因.我國患各種血栓病的患者估計在1300萬以上.對于血栓病的治療方法多種多樣,但目前主要的療法仍是溶血栓法.組織型纖溶酶原激活劑做為第二代特異性的溶栓藥于1987年被FDA批準上市.它是由美國Genetich公司用CHO細胞表達的,也是第一個用動物細胞大規模培養生產的基因工程產品.

3.3 尿激酶原

作為第二代的又一個特異性的溶栓藥,單鏈尿型纖溶酶原激活劑-尿激酶原目前在許多國家進行臨床Ⅲ期試驗,估計不久即可上市.在國內,南京大學是用大腸桿菌表達的,而軍事科學院生物工程研究所則是用CHO細胞表達的,目前正和天津天士力公司一起進行試驗.尿激酶原是一種堿性蛋白,具有特異的溶血栓作用,具有很好的發展前景.

3.4 促紅細胞生成素

促紅細胞生成素,又稱血細胞生成素、紅細胞刺激因子,是一種酸性糖蛋白,是第一個被發現并批準應用于臨床的造血生長因子,也是迄今為止產值最高的基因工程產品.它主要用于多種貧血,包括慢性腎衰性貧血、惡性腫瘤放療和化療引起的貧血等.由于該藥的用量很小,因此有的單位仍采用傳統的轉瓶生產工藝.也有單位為了達到高產目的,采用了固定化灌流培養的生產工藝.

3.5 凝血因子Ⅷ

由先天性缺乏凝血因子Ⅷ而引起的出血稱為甲型血友病,早期治療采用輸入全血或血漿,但由于血漿內凝血因子Ⅷ的濃度很低,因此效果不理想.20世紀80年代以后,采用單克隆抗體親和層析,使產品的純度進一步提高.尤其是由于研究成功了一系列血漿的病毒滅菌法后,使由血漿制備的"極純"產品,如Monoclate等一直沿用至今.

3.6 乙型肝炎疫苗

乙型肝炎是由乙肝病毒引起的,約占所有病毒性肝炎的40%,它可以急性發病也可以形成慢性肝炎,并進而引發肝硬化、肝癌,而其中很大的一部分人是健康的病毒攜帶者,不出現癥狀,但表面抗原陽性,常常是重要的傳染源.在我國,這樣的慢性病毒攜帶者約有一億人,是對公共衛生的一個重要威脅.

至今已被批準的乙肝工程疫苗有兩種宿主細胞的,一種是酵母表達的,另一種是CHO細胞表達的.我國病毒研究所的任貴方等在1987年就研究成功了用CHO細胞表達的疫苗.他們用的是NBS公司生產的微載體籃式生物反應器連續灌注培養CHO細胞,然后以14000r/min連續離心去除細胞殘骸提取上清,再經Butyl S Sepharose Fast Flow 疏水柱層析-Sephadex G 25脫鹽-DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析-Sepharose 4 Fast Flow 凝膠過濾,即可得純品[17].

四 展望

動物細胞工程制藥是從疫苗開始的,迄今已有悠久的歷史.動物細胞工程制藥中目前運用的主要手段有:細胞融合、核移植、轉基因動物、細胞培養等.隨著細胞工程技術研究的不斷深入,我們必能開發出更具有安全性,有效性的技術手段.目前已研發的細胞產品實例主要有類淋巴細胞干擾素,組織型纖溶酶原激活劑,尿激酶原,促紅細胞生成素,凝血因子Ⅷ,乙型肝炎疫苗.隨著繼續深入的研究,更多的不同結構的細胞產品將應用于臨床.

動物細胞工程不僅可大量工業生產天然稀有的藥物,而且其產品具有高效性和對疾病鮮明的針對性.因而,動物細胞工程藥物的發展必將給制藥工業帶來一次革命性飛躍,在人類的醫療保健中發揮越來越重要的作用.

作為現代生物技術之一的細胞工程技術在近半個世紀來突飛猛進,并已在醫藥領域取得了許多具有開創性的研究成果,如通過細胞融合技術形成的雜交瘤細胞生產的單克隆抗體已廣泛用于臨床治療, 并顯示出獨特的療效, 獲得了很好的社會和經濟效益.隨著細胞工程技術研究的不斷深入,它的前景及其產生的影響將會日益地顯示出來.

參考文獻

[1] 李剛,劉鵬,劉誠迅等. 我國細胞工程制藥的研究現狀和發展前景[J].中國現代應用藥學雜志.2002,8,19\\(4\\):278.

[2] 胡顯文,肖成祖.細胞工程在生物制藥工業中的地位[J].生物技術通訊.2011,5,12\\(2\\):118.

[3] 唐祖明,鄭紀山,肖中黨等.甲肝病毒單克隆抗體的研制與應用[J].東南大學學報\\(自然科學版\\),2000,30 \\(5\\):21.

[4] 姚彩霞,李滬霞.抗人Ig M單克隆抗體的研究-脾內免疫建立抗人Ig M單克隆抗體雜交瘤細胞株[J].微生物學免疫學進展,1998年,26 \\(1\\):66.

[5] 劉彥君,王皓,衛立辛等.人肝癌細胞與自體激活B淋巴細胞融合制備腫瘤疫苗[J].第二軍醫大學學報,1998,19 \\(6\\):507.

[6] 張京航,賀武.抗人結腸癌雜交瘤細胞系的建立及單克隆抗體特性研究[J].細胞與分子免疫學雜志,1997,13 \\(2\\):25.

[7] 楊學輝,劉彥信,陳永春.重組人巨噬細胞集落刺激因子受體胞外區蛋白的純化及單抗的制備[J].河北醫科大學學報,2000,21 \\(4\\):196.

[8] 譚曉紅,楊曉,程萱等.核移植技術生產乳腺生物反應器的研究進展[J].生物工程進展,2000,20 \\(6\\):46.

[9] 韓建永,常萬存,桑潤滋等.家兔胚胎細胞核移植的研究[J].河北農業大學學報,2000,23 \\(2\\):1.

[10] 王玉閣,鄒賢剛,成國祥等.由胎兒成纖維細胞而來的克隆山羊 \\(Capra hircus\\).科學通報,1999,44 \\(21\\):2319.

[11] 曾溢滔.轉基因動物與生物醫藥產業[J].生物學通報,1999,34 \\(4\\):1.

[12] 黃淑幀,張克忠,黃英等.乳汁中分泌有活性的人凝血因子IX的轉基因羊的研制[J].科學通報,1998,43 \\(7\\):783.

[13] 林福玉,陳昭烈,劉紅等.大規模動物細胞培養的問題及對策[J].生物技術通報, 1999,1:32.

[14] 陳昭烈.動物細胞培養過程中的凋亡[J].生物工程進展,1998,18\\(6\\):17-20.

[15] 吳梧桐.下一個10年的生物技術與生物制藥[J].中國藥學雜志,1999,34\\(1\\):3-6.

[16] 鄒壽長,李干祥,楊葆生等.大規模動物細胞培養技術研究進展[J]. 生命科學研究,2001,5\\(2\\):102

[17] 夏煥章,熊宗貴.生物技術制藥\\(B\\).北京:高等教育出版社,,