蛋白質晶體學是研究蛋白質結構與功能關系的重要方法． 近年來，同步輻射光源強度的提高和晶體結構解析方法的更新都獲得了快速的發展，但是蛋白質的結晶仍然是晶體學中的瓶頸． 蛋白質的結 晶 包 括 最 初 的 結 晶 條 件 的 摸 索 \\( de novocrystallization screening \\) 和 結 晶 條 件 的 優 化\\( crystallization optimization\\) 兩個步驟． 最初條件的摸索主要依靠高通量的篩選． 結晶條件的優化除了改變蛋白和沉淀劑濃度，加入添加劑等方法外，晶胞接種法在其中具有重要的作用． 晶胞接種法包括微晶胞接種法和大晶胞接種法． 微晶胞接種法主要用于得到單晶來改善衍射質量，而大晶胞接種法則主要用于得到大體積的單晶來提高衍射分辨率．由于第三代 X-光同步輻射的強度非常高，蛋白晶體X-光衍射所需體積一般而言在 10－ 6～ 10－ 4立方毫米就足夠了，因此大晶胞接種法在 X-光衍射晶體結構學中的應用已經趨少． 但是，X-光衍射是對蛋白質中原子或離子的電子產生的衍射，它只能測出電子含量比較多的“重”原子或離子\\( 碳、氮、氧、磷、硫等\\) 的空間位置，而對只有極少電子的極性氫原子\\( H3O+，－ OH，H2O，－ NH － ，－ NH2，－ NH3等基團中的氫原子或離子\\) 則無法檢測出，即使是在高于1. 0 \ue6a6 分辨率的 X-光衍射晶體結構中也是如此．蛋白晶體的中子衍射是對原子或離子的原子核產生的衍射． 氘原子\\(2H\\) 作為氫原子\\(1H\\) 的同位素，對中子衍射非常敏感． 將蛋白質中的氫氘置換后，氘的空間位置在 2. 0\ue6a6 的分辨率就可以清晰地被中子衍射檢測到，這樣我們可以很準確地推斷出原先蛋白質中氫的位置． 得到蛋白質中氫原子的空間位置對研究蛋白催化反應的機理、蛋白的熱動力學和蛋白-藥物相互作用的分析都具有重要的意義． 然而，由于技術原因，中子輻射的強度只有X-光輻射強度的百萬分之一，因此在大多數情況下只有 1 立方毫米以上體積的巨大晶體才有足夠的分辨率觀察到蛋白質中的氫原子或質子． 截至到2013年 8 月 30 日，在國際蛋白結構數據庫中，蛋白晶體的 X-光衍射結構有 674 789 個，而中子衍射結構只有區區43 個，只占晶體結構總數的 0. 06% ． 造成這種結果的主要原因除了晶體的中子衍射所需時間長\\( 10 d以上\\) 以外，得到 1 立方毫米以上體積的巨大晶體相當困難是另一個主要原因． 因此，如何進一步發展大晶胞接種法，獲得巨大體積的蛋白晶體就顯得非常重要．本文以非聚合性肌動蛋白\\( AP-actin\\)和里氏木聚糖酶為研究對象，詳細探討了微晶胞接種法和大晶胞接種法在結晶時的應用． 非聚合性肌動蛋白的 X-光衍射晶體結構雖然已經發表，但是通過連續多步微晶胞接種的方法得到高分辨率的單晶在相關文獻中沒有報道． 里氏木聚糖酶雖然已經被研究多年，在蛋白晶體結構數據庫中有 293 個 X-光衍射晶體結構，但是中子衍射晶體結構則一個也沒有． 本文討論了如何通過大晶胞接種的方法得到體積到達 2 立方毫米的里氏木聚糖酶晶體，其中子衍射分辨率達到 2. 0 \ue6a6，從而為它的中子衍射晶體結構的研究打下堅實的基礎．

1 材料與方法

1. 1 材料

木聚糖酶突變體\\( N44D 和 E177Q\\) 的基因構建購自美國 DNA2. 0 公司\\( 里氏木聚糖酶基因采用編碼子優化合成后，克隆到 pJexpress401 表達載體上\\) ．非聚合性肌動蛋白\\( AP-actin\\) 由美國佛蒙特大學Kathleen Trybus 實驗室提供． 蛋白胨\\( trypton\\) 和酵母提取物\\( yeast extract\\) 購自美國 Invitrogen 公司．HiTrap SP-Sepharose 強陽離子交換柱和 HiLoad 16 /60 Superdex75 pg 分子篩柱購自美國 GE 公司． 結晶試劑盒 Crystal ScreenTM、IndexTM、PEG·IonTM、PEGＲx購自美國 Hampton Ｒesearch 公司． 其它化學試劑購自美國 Sigma 公司． 大腸桿菌 BL21-gold 細胞株由本實驗室保存．

1. 2 木聚糖酶的表達與純化

100 μL 感受態細胞在冰上溶解后，加入 1 ～ 3μg 的質粒． 靜置 10 min 后，放入42 ℃水浴 45 s． 在冰上冷卻 5 min 后，加入 900 μL 無菌的溶源性肉湯\\( lysogeny broth，LB\\) ，放入37 ℃培養1 h． 6 000 g 離心后，去掉 900 μL 上清液． 剩下 100 μL 培養液同細胞混勻后鋪到含卡拉霉素的瓊脂糖平板上，37 ℃培養過夜． 挑出長出的單菌落進行細胞培養和蛋白表達．轉化細胞接種到 50 mL 的 LB \\( Luria-Bertani\\)培養液 37 ℃培養過夜． 取 10 mL LB 培養液到 1 LEnfor’s 基本培養基中，37 ℃ 培養到 A600吸收值在 0. 4 ～0. 8 之間后，降溫到18 ℃，加入 0. 5 mmol/LIPTG 誘導蛋白表達． 6 000 g 離心去除培養液后，細胞用 50 mmol/L MES 緩沖液\\( pH6. 0\\) 懸?。?細胞用超聲破碎后，15 000 × g 離心去除細胞碎片． 上清液過 20 mL HiTrap SP-Sepharose 填充柱進行第一次蛋白純化． 用 0 ～1 mol/L 氯化鈉濃度梯度洗脫后，純化的蛋白用 Centricon\\( Millipore 公司產品\\) 離心濃縮到小于 2 mL 體積． 濃縮液過 12 mL HiLoad 16/60Superdex 75 pg 分子篩柱在 0. 1 mol / L Tris 緩沖液\\( pH8. 5\\) 進行第二步蛋白純化． 洗脫液的純度經SDS-PAGE 檢測后，濃縮到 30 ～ 50 mg / mL 在-80 ℃保存．

1. 3 木聚糖酶突變體 E177Q 的結晶和微晶胞接種

木聚 糖 酶 突 變 體 E177Q 和 底 物 木 聚 六 糖\\( xylohexaose\\) 形成的復合物\\( E177Q-X6\\) 的結晶條件用懸滴法來進行摸索: 1 μL 復合物溶液\\( 30 mg/mL E177Q，0. 1 mol / L NaCl，0. 1 mol / L Tris，pH8. 5，50 mmol / L Xylohexaose\\) 與 1 μL 池液\\( 具體成分視結晶條件試劑盒的成分而不同\\) 混合后，與 0. 5 mL池液在封閉的環境下平衡．將最初得到的 E177Q-X6 晶體聚合物\\( Fig． 1A\\)從結晶溶液中轉移到沉淀劑濃度升高了 2% ～ 5%的穩定液中\\( stabilization solution\\) ，然后用灼燒過的毛細玻璃管壓碎，再將體式顯微鏡也無法見到的微晶體溶液用穩定液梯度稀釋 10 倍、100 倍、1 000 倍和 10 000 倍． 從上述 100 倍、1 000 倍和 10 000 倍的稀釋液中分別吸取 0. 4 μL 小晶體溶液，加入到預平衡好的蛋白結晶溶液中\\( 結晶沉淀劑濃度比最初結晶溶液的沉淀劑濃度降低 2% ～5%\\) ．

1. 4 木聚糖酶突變體 N44D 的結晶和大晶胞接種

木聚糖酶突變體 N44D 的無配體蛋白溶液\\( 30mg/ mL N44D，0. 1 mol / L NaCl， 0. 1mol / L Tris\\( pH8. 5\\) \\) 的最初結晶條件采用懸滴法用不同試劑盒來篩選\\( 同上\\) ．將得到的 N44D 單晶從結晶溶液中轉移到降低了沉淀劑濃度\\( 2% ～ 5%\\) 的池液中，多次清洗后，再將這個單晶轉移到預平衡好的大體積\\( 100 μL\\)蛋白結晶溶液中\\( 結晶沉淀劑的濃度同樣比最初降低 2% ～ 5%\\) ． 由于懸滴法不能用大體積蛋白溶液，本文采用美國 Hampton Ｒesearch 公司生產的可以承 載 大 體 積 的 9 孔 玻 璃 盤 在 三 明 治 盒 子\\( Sandwich Box\\) 中以坐滴的方式來得到大體積單晶．

1. 5 肌動蛋白的結晶和多次微晶胞接種

非聚合性肌動蛋白同 ATP 復合物\\( 10 mg/mLactin，5 mmol / L Tris-HCl， pH 8. 2，0. 2 mmol / LCaCl2，0. 1 mmol/L sodium azide，0. 5 mmol/L DTT，0. 2 mmol / L ATP\\) 結晶條件用懸滴法來篩選 \\( 同上\\) ． 肌動蛋白的微晶胞接種過程與木聚糖酶E177Q-X6 過程相同，但是重復多次．

1. 6 晶體衍射數據的收集和處理
晶體的 X-光衍射數據收集過程如下: 將木聚糖酶晶體從結晶溶液撈出后，在含 20% 甘油的穩定液中浸泡一下后撈出，在液氮中快速冷凍． 20% 甘油作為冷凍保護劑\\( cryoprotectant\\) 使得冷凍的晶體周圍不會有冰晶形成． 肌動蛋白晶體溶液中含有25%2-methyl-2，4-pentanediol\\( MPD\\) ，本身可以作為冷凍保護劑，可以將晶體直接在液氮中冷凍． 晶體衍射數據由 Ｒigaku ＲUH3Ｒ 發生器和 Mar345 成像板構成的 X-光衍射儀收集，并用 HKL2000軟件處理．晶體的中子衍射數據收集過程如下: 將木聚糖酶突變體 N44D 的大體積晶體\\( 2 ～ 3 立方毫米\\) 放入石英玻璃管中，然后在玻璃管的末端加入用重水\\( deuterium oxide\\) 配制的穩定液． 在 18 攝氏度放置4 周后，晶體中 80% 可置換氫已經被氘取代． 晶體的中子衍射數據在美國 Los Alamos 國家實驗室的蛋白晶體站\\( Protein Crystallography Station，PCS\\)收集后，用勞厄中子衍射\\( Laue Neutron Diffraction\\)程序處理．

2 結果

2. 1 微晶胞接種可以極大地改善晶體衍射質量

用結晶條件試劑盒篩選木聚糖酶突變體 E177Q與底物木聚六糖形成的復合物 E177Q-X6 的懸滴法結晶條件如下: 1 μL 的池液\\( 0. 2 mol/L ammoniumcitrate tribasic\\( pH 7. 0 \\) ，20% PEG 3350 \\) 加 1 μLE177Q-X6 復合物溶液\\( 30 mg / mL E177Q，0. 1mol / LNaCl， 0. 1 mol / L Tris， pH8. 5， 50 mmol / LXylohexaose\\) ，與 0. 5 mL 池液平衡 2 d 后晶體形成，5 d 后晶體長到最大． 由于最初獲得的 E177Q-X6復合物晶體長在一起無法分離成單晶，我們從原來的多晶中切下一小塊長得最好的部分，壓碎，得到非常小的細微晶體，再用微晶胞接種的方法得到單晶． 單晶的 X-光衍射分辨率可以達到1. 1 \ue6a6．肌動蛋白的懸滴法結晶條件如下: 1 μL 蛋白溶液與 1 μL 池液 \\( 20 mmol/L CaCl2，100 mmol/LNaAc，25% MPD，pH4. 8\\) 混合后，與 0. 5 mL 池液混合，在 4℃平衡． 1 天后晶體出現，5 天后晶體長到最大． 得到的多個細小晶體長在一起，無法分開． 第一次微晶胞接種后，得到的晶體雖然有所改善，但是仍然是衍射質量很差的多晶體混合物． 繼續用微晶胞接種的方法改進晶體質量，在第四輪接種后，終于得到 10 μm × 10 μm × 100 μm 單晶． 這個單晶的 X-光衍射分辨率達到 1. 9 ．

2. 2 大晶胞接種法可以得到大體積單晶

木聚糖酶突變體 N44D 的結晶條件如下: 1 μLN44D 溶液與 1 μL 池液\\( 15% PEG8000，0. 2 mol / LNaI，0. 1 mol / L MES 緩沖液，pH6. 0\\) 混合后，與 0. 5mL 池液平衡． 2 d 后晶體出現，5 d 后晶體可以長到0. 1 mm × 0. 2 mm × 0. 2 mm． 這樣體積的晶體對中子衍射遠遠不夠，必須進行大晶胞接種． 在大晶胞接種的過程中，這個從原先結晶溶液中撈出的小單晶必須先在池液中清洗幾次以去除可能在晶體表面附著的其它微小晶體． 否則，多個晶體會長在一起形成多晶體． 由于池液中的沉淀劑濃度比結晶溶液中的沉淀劑濃度低，作為晶核的小晶體會有一定程度的溶解． 這樣，小晶體表面鋒利的邊緣會消失，晶體體積減小，甚至在晶體表面出現裂縫． 這個小晶體加入到預平衡的 100 μL 結晶溶液后，蛋白分子不斷地從溶液中析出并附著到小晶體表面上，使得小晶體不斷長大，20 d 以后達到 2 mm3\\( 0. 8 mm × 0. 9 mm × 3 mm\\) ． 在轉移晶體的過程中不能摩擦晶體表面，避免極細微的晶胞被刮下，造成多個晶核被引入結晶溶液中． 大晶胞接種的過程中，最好只有 1 個晶體在溶液中生長，這樣可以有盡可能多的蛋白附著于其上，使其體積長到最大． 這個大晶體的中子衍射分辨率為 2. 0 ．

3 討論

得到衍射質量高的晶體是蛋白質晶體結構研究的難點． 雖然結晶點樣機器人能大規模地利用結晶試劑盒篩選最佳的初始條件，但是在很多情況下得到的初始晶體不是單晶，晶體的衍射圖譜不能被用于解 析 結 構． 根 據 結 晶 相 圖 \\( crystallizationdiagram\\)，晶體成核區\\( nucleation zone\\) 往往有大量的小晶體形成． 如果晶體形成的速度過快，它們會長在一起形成多晶體． 在相圖的亞穩定區，沒有新的晶體形成，已經形成的晶體會繼續長大直到蛋白溶解曲線的邊緣． 微晶胞接種法其實就是利用成核區和亞穩定區的分別將微小晶體直接引入亞穩定區來得到高質量的晶體． 這些在體式顯微鏡中也看不到的細微晶體是從原來的晶體上“刮”下來的，它們的晶型往往比原來的母晶要好，所以以它們為種子長出的晶體的質量會有很大地改善． 當一次微晶胞接種不能獲得高質量的單晶時，重復多次微晶胞接種可以最終得到滿意的效果． 在微晶胞接種的過程中，穩定液中沉淀劑濃度一般要比原來結晶溶液的沉淀劑濃度要高． 這樣可以有效地避免微晶胞被溶解而不能被引入新的結晶溶液的情況發生． 經過預平衡的新結晶溶液的沉淀劑濃度比最初結晶溶液要低，這樣可以使晶體的生長處于亞穩定區而沒有新的晶體形成．連續多次微晶胞接種法可以極大地改善蛋白晶體的衍射質量． 本文以肌動蛋白為例，詳細介紹了這種方法的應用和重要作用，從而豐富了微晶胞接種法的內容．本文采用每 10 倍梯級稀釋的方法來獲得微晶胞原液，這樣可以控制原液中的微晶胞數目，不至于將過多的晶胞引入結晶溶液中而只能得到過小體積晶體． 根據我們的經驗，100 倍和 1 000 倍的稀釋度最為適合． 但是不同的蛋白晶體的稀釋度還是要通過實驗來確定． 微晶胞原液最好新鮮配制．在大晶胞接種的過程中，單個大晶胞從最初的結晶溶液中取出后，要在穩定液中快速清洗幾遍，才能加入到新的預平衡好的結晶溶液中． 這個穩定液中沉淀劑濃度一般比原先要低，這樣可以溶解晶體表面可能存在的其它小晶胞． 由于這個被轉移的晶體比較大，清洗的過程不會將整個晶體都溶解． 在清洗的過程中晶體可能會出現裂縫等現象，但是在新的結晶溶液中長大后，晶核只占整個大晶體中很小一部分，不會影響到晶體的衍射質量． 穩定液中沉淀劑濃度的差別是微晶胞接種法和大晶胞接種法之間最顯著的差別． 新的結晶溶液的體積至少是 30 μL，這樣可以有足夠多的蛋白連續附著到晶核的表面供其生長． 單個晶胞在轉移的過程中，必須特別小心，不能有細微的小晶體從表面上被刮下來，從而造成多個晶體都去爭奪溶液中的蛋白供其生長． 這樣只有一個晶體在結晶溶液中生長，其體積可以達到最大． 以往的大晶胞接種法得到的晶體體積不到 1 mm3的主要原因就在于結晶溶液中有多個晶核存在，不能集中所有蛋白到一個晶體的生長．應用大晶胞接種法來獲得體積為 1 mm3以上的巨大晶體非常有效． 本文以木聚糖酶為例，詳細討論了大晶胞接種法操作的細節和應該注意的問題． 它對以大體積晶體為基礎的中子衍射結構學的發展，具有重要的意義．

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