蜘蛛絲擁有優異的機械和生物學性能，是一種理想的多功能材料。由于蜘蛛自相捕食和產絲量小等，通過馴養蜘蛛獲取大量蛛絲纖維的難度較高，因此采用生物技術的方法重組表達蜘蛛絲蛋白成為獲取仿生蜘蛛絲纖維的主要途徑。
到目前為止，在蛛絲仿生領域仍未取得突破，仿生的擬蛛絲纖維性能遠不及天然蛛絲。研究表明蛛絲蛋白的高分子量特性和成絲模式是決定絲纖維性能的重要因素，現已成為研究的熱點。典型的蛛絲蛋白由氨基端\\(N terminal，NT\\)、羧基端\\(C terminal，CT\\)以及占到>90%的重復區\\(Re－peat，R\\)構成。NT 和 CT 高度保守，在蛛絲蛋白的分泌、儲存和成絲等過程中起重要的調節作用。
隨著 pH 的降低\\(中性到酸性\\)，NT 二聚化，形成蛋白網絡；CT 則能促進蛛絲蛋白的排列和可溶性的提高等，具體功能尚不清楚；R 主要與蜘蛛絲性能相關。另外，蛛絲蛋白纖維化還受到鹽離子的影響，如氯化鈉能夠維持主壺腹腺絲蛋白\\(major ampullate spidroin，MaSp\\)NT 單體的穩定性等。由于主壺腹腺體容易分離，分泌的主壺腹腺絲性能突出等優點，長期以來一直受到青睞。
2012 年本課題組獲得首條次壺腹腺絲蛋白\\(Minorampullate spidroin，MiSp\\)全長編碼序列，經比對分析得知 MiSp 和 MaSp 的 CT 同源性較高，但MaSp CT 含有兩個保守半胱氨酸\\(Cysteins\\)，通過二硫鍵相互作用，形成平行二聚體；MiSp CT 則沒有 Cys，二聚化機制和生物學功能尚未得到充分證實。
為了進一步研究蜘蛛絲蛋白 MiSp 重復區 R和羧基端 CT 的二級結構和功能，本實驗通過克隆并在大腸桿菌 Rosetta 2\\(DE3\\)中分別表達R1R2CT和 R1R2 兩個組合模塊蛋白，借助 Ni-NTA 親和色譜純化，利用圓二色譜\\(circular dichroism，CD\\)測定并分析了不同 pH 條件下的重組蛋白 R1R2和 R1R2CT 二級結構特性；采用掃描電子顯微鏡\\(scanning electron microscope，SEM\\) 表征 R1R2 和R1R2CT 重組蛋白在不同 pH 及離子條件下的聚集和成絲情況，為成絲機理的研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
質粒抽提試劑盒、DNA 膠回收試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司；EcoRⅠ、HindⅢ、BsaⅠ限制性內切酶和 phusion High-Fidelity PCRMM buffer 購自 NEB 公司 \\(美國\\)；T4 DNA 連接酶購自 Fermentas 公司 \\(美國\\)；6×his 抗體購自天根公司；Ni-NTA 樹脂購自 Qiagen 公司\\(德國\\)。
1.2 方法
1.2.1 克隆構建
以 MiSp 全長基因為模板 \\(GenBank 登錄號:
JX513956\\)，以 R1p1 和 R1p2 為引 物 PCR 擴增R1，以 R2p1 和 R2p2 為引物 PCR 擴增 R2。BsaⅠ酶切 R1 和 R2，酶切片段回收后由 T4 連接酶體外連接 R1 和 R2；以連接產物為模板，以 R1p1 和R2p2 為引物擴增 R1R2；R1R2 由 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ酶切，膠回收后的酶切片段與擁有相同酶切位點的載體連接。以 R1R2 為模板，以 R1R2p1 和R1R2p2 為引物擴增片段 R1R2，以 CTp1 和 CTp2為引物擴增 CT；R1R2 和 CT 分別由 BsaⅠ酶切，酶切片段回收后體外連接，連接產物用作模板，以R1R2p1 和 CTp2 為引物擴增 R1R2CT， 產 物經EcoRⅠ和 HindⅢ酶切后與載體連接，引物序列見表 1，具體克隆構建過程如圖 1。
將測序正確的重組質粒轉化于 Rosetta 2\\(DE3\\)感受態細胞。挑取單克隆接種于 5 mL LB 培養基\\(含卡那霉素 30 mg/L\\)。200 r/min，37 ℃過夜培養。將 5 mL 過夜培養物接種于 500 mL 新鮮LB 培養基 \\(含卡那霉素 30 mg/L\\)，37 ℃震蕩培養至 OD600為 0.9 左右，溫度降至 25 ℃時加入終濃度為 0.3 mmol/L 的 IPTG，25 ℃誘導培養 4 h，離心 10 min \\(8 000 r/min，4 ℃\\)收集菌體，加入 30 mL20 mmol/L Tris pH 8.0 重懸菌體，200 W 超聲破碎\\(超聲 5 s，間隔 8 s\\)60 次，低溫高速離心 30 min\\(12 000 r/min，4 ℃\\)收集上清。
1.2.3 蛋白表達產物純化和分析
上清中重組蛋白與 Ni-NTA 結合，由含有 50mmol/L 咪唑的 20 mmol/L Tris pH 8.0 進行完全洗滌，最后由含有 300 mmol/L 咪唑的 20 mmol/LTris pH 8.0 洗脫蛋白。純化過程中，收集穿柱液\\(Flow through\\)、洗滌液\\(Wash\\)、洗脫液\\(Elution\\)，并各取出 20 μL，加入 5 μL 的 5X SDS-PAGE 上樣緩沖液，100 ℃水浴 10 min，取適量樣品經 12%SDS-PAGE 電泳后進行染色和脫色分析。樣品經12% SDS-PAGE 凝膠電泳后進行恒流電轉移，轉移到 PVDF 膜，以 6×his 組氨酸標簽作為檢測抗原，對表達的融合蛋白進行 Western blot 來進一步檢測，具體方法參照 Invitrogen 操作手冊。
1.2.4 重組蛋白二級結構測定
實驗中采用 CD 測定所有蛋白的二級結構，均使用上海交通大學分析測試中心的 JASCO J-815 圓二色譜儀。終濃度為 0.1 g/L 的重組蛋白R1R2 和 R1R2CT 分別溶于 pH 5.5、6.5 和 7.5 的PBS 磷酸鹽溶液中，從 190～260 nm 的波長范圍收集信號，測試所用比色皿大小為 1 mm。
1.2.5 掃描電子顯微鏡測試分析
終濃度為 10 μmol/L 的重組蛋白 R1R2 和R1R2CT 分別溶于 6 種不同 pH 和鹽離子的溶液中: 20 mmol/L PBS pH 5.5、20 mmol/L PBS pH 6.5、20 mmol/L PBS pH 7.5、20 mmol/L PBS pH 5.5\\(含有 154 mmol/L NaCl\\)、20 mmol/L PBS pH 6.5\\(含有154 mmol/L NaCl\\)、20 mmol/L PBS pH 7.5 \\( 含 有154 mmol/L NaCl\\)，于 37 ℃ 250 r/min 震蕩培養12 h，培養液\\(纖維\\)由東華大學化學化工與生物工程學院日立 TM-1000 臺式掃描電鏡測試分析。
2 結果
2.1 重組子的鑒定
R1R2 和 R1R2CT 分別與經改造的載體 pHTH連接，重組子質粒送上海生工生物工程有限公司正反向測序，測序結果經比對和分析確定無突變，可用于后續的重組蛋白表達。
2.2 重組蛋白表達和純化
R1 和 R2 主要由甘氨酸 \\(Glycine\\) 和丙氨酸\\(Alanine\\) 組成，CT 序列中 Gly 和 Ala 較少，R1R2和 R1R2CT 的氨基酸序列見圖 2。超聲破碎經IPTG 誘 導表 達 的 R1R2 和 R1R2CT Rosetta 2\\(DE3\\)菌體，高速離心后的上清由 Ni-NTA 柱純化\\(Qiagen 純化方法\\)。目的蛋白與 Ni-NTA 結合效率較高，洗脫后重組蛋白由 SDS-PAGE 檢測，圖譜顯示目的蛋白可達到較好的純度 \\(圖 3A、B\\);Western blotting 圖譜進一步證明重組蛋白的大小和完整性\\(圖 3C\\)。
2.3 二級結構測定
我們采用 CD 技術分別測定于 pH 7.5、6.5 和5.5 的 PBS 溶液中重組蛋白 R1R2 和 R1R2CT 的二級結構特征。R1R2 在 3 種不同的 pH 中結構相似，主要為無規卷曲構象\\(圖 4\\)。R1R2CT 在 208 nm和 222 nm 處呈現負峰，是典型的螺旋峰型\\(圖 5\\)。
我們的 NMR 結果證實 CT 為五 α 螺旋結構，且隨著 pH 值的降低，峰值信號向上偏移\\(未發表\\)。
2.4 掃描電鏡分析
重組模塊蛋白 R1R2、R1R2CT 分別溶于 6 種不同 pH 值和離子條件下的溶液中：20 mmol/LPBS pH 5.5、20 mmol/L PBS pH 6.5、20 mmol/LPBS pH 7.5、20 mmol/L PBS pH 5.5 +154 mmol/LNaCl、20 mmol/L PBS pH 6.5 +154 mmol/L NaCl、20 mmol/L PBS pH 7.5+154 mmol/L NaCl，終濃度為 10 μmol/L.蛋白溶液經 250 r/min，37 ℃震蕩培養 12 h 后，電鏡結果顯示，R1R2 和 R1R2CT 在pH 7.5 和 pH 6.5 條件下均無可見的纖維產生。pH5.5 時，R1R2CT 形成纖維束，表面形態光滑、形態整齊; 而 R1R2 則形成較為松散的纖維，表面較為粗糙，呈扁平條帶狀。加入 154 mmol/L 氯化鈉后，R1R2CT 表面粗糙，蛋白聚集不均勻，形成纖維形態較差; RIR2 形成的纖維量較少，但形態與無氯化鈉相似，表面形態較無氯化鈉時粗糙且不平整。
3 討論
蛛絲蛋白由蜘蛛腹部腺體分泌產生，如 MaSp由主壺腹腺分泌、MiSp 由次壺腹腺分泌以及鞭毛狀絲蛋白\\(Flag\\)由鞭毛狀腺分泌等，主壺腹腺和次壺腹腺結構相似。蛛絲蛋白在纖維化過程中 pH 值從 7.6 降到 6.3\\(當前可測定的最低 pH值\\)，同時離子濃度和種類亦發生變化，最后在剪切力作用下形成高品質的絲纖維。2007 年，PloSONE 報道了首條 MaSp 全長基因組序列，蛋白序列分析表明，MaSp 由 NT、CT 以及占到 95%以上的重復區 R 組成條 MiSp 全長基因組序列，與 MaSp 相似，MiSp 亦由 NT、CT 和 R 組成，R 占主要部分。6種蛛絲纖維分別擁有不同的機械性能，主要由不同的重復區 R決定；NT 和 CT 在蛛絲蛋白的成絲過程中主要起到調節、促溶以及利于纖維蛋白排列等作用。
MiSp 重 復 區 域 R 主 要 由 poly -Alanine\\(polyA\\)，Glycine -Glycine -X \\(X 為 其 他 氨 基 酸 ，GGX\\)以及 Glycine-Alanine\\(GA\\)等模塊組成，組成的次壺腹腺絲擁有類似拖絲的機械性能。結構分析發現，polyA 和 GA 均能形成 β-sheet 結構，在固態絲纖維中整齊排列形成晶體區域，決定絲素蛋白的強度。GGX 形成 310-helix，形成絲纖維的無定型區域，決定絲纖維的延展性能。另外，MiSp中還帶有特殊的 Spacer 區域，但到目前為止，該模塊的功能尚不清楚，我們推測該模塊與延展性相關。在自然進化中，重復區變化較大，但是CT 在序列和結構上高度保守，研究發現 MaSp CT可以穩定絲蛋白，阻止過早的聚集，并且能夠調整重復區的排列而形成表面形態更好的絲纖維。
2010 年，NATURE 報道了 MaSp CT 的高級結構，解釋了它在溶液中的結構形態和它與絲蛋白儲存和自組裝轉變的密切相關性。另外，MaSp CT 在調整重復區 R 二級結構方面扮演著重要的角色，這對于絲纖維的機械性能具有很重要的作用。
為了進一步研究 R 和 CT 模塊的功能，我們構建了 R1R2 和 R1R2CT 兩個重組克隆。通過BsaⅠ限制性內切酶的介導，我們將 R1 和 R2 以及 CT 三段無縫連接\\(圖 2\\)，排除了由酶切位點引入外源氨基酸的干擾。由于 R1、R2 以及 CT 中均含有稀有密碼子，因此我們選擇 Rosetta 2 \\(DE3\\)作為表達宿主菌體來消除稀有密碼子的影響。表達及純化結果表明 \\(圖 3\\)，重組蛋白 R1R2 和R1R2CT 均可在 Rosetta 2 \\(DE3\\)中大量表達，采用Ni-NTA 純化柱純化可得到純度較高的重組蛋白\\(圖 3\\)。Western blotting 結果也證實了重組蛋白R1R2 和 R1R2CT 的完整性和純度。R1R2 主要由ploy-A、GA 以及 GGX 組成，CD 圖譜顯示\\(圖 4 和5\\)，R1R2 重組蛋白在 PBS 溶液中主要為無規卷曲構象，R1R2CT 則擁有 α 螺旋的兩個特征負峰值。
我們的其他實驗數據表明，MiSp CT 為五 α 螺旋構象，隨著 pH 的降低，峰圖向上偏移，表明二級結構出現細微的變化 \\(未發表\\)。R1R2 為無規卷曲，R1R2CT 為 α 螺旋構象，我們推測 CT 可以促進重復區 α 螺旋等構象的形成。我們在 3 種不同的 pH 值及有無 154 mmol/L NaCl 的條件下，37 ℃250 r/min 震蕩培養上述兩種重組蛋白 12 h，樣品經 SEM 分析 \\(圖 6\\) 表明，在 pH 7.5 和 6.5 時，R1R2CT 和 R1R2 均無法形成纖維，pH 值降到 5.5時，可形成纖維。R1R2CT 可形成表面形態良好的重組纖維，且纖維成纖維束狀\\(圖 6 中顯示為 4 根單纖維的混合\\)，單根纖維表面光滑，呈立體圓形，大小均勻。只有重復區的 R1R2 重組蛋白則不同，形成的纖維為扁平帶狀，大小不均勻。文獻記載MaSp 重復區 R 重組蛋白無法形成纖維，只有加上 CT 后才能形成可見纖維。通過本實驗，我們證實單獨的 MiSp R1R2 重組蛋白也可形成纖維，只是纖維形態較 R1R2CT 不平整，呈條帶狀。
因此，CT 有利于絲蛋白的排列組裝而形成較為緊密的重組纖維。NaCl 能夠維持 MaSp NT 單體穩定性，不利于絲蛋白的纖維化。這里我們進一步證實，在 154 mmol/L NaCl 存在的條件下，R1R2和 R1R2CT 均可形成纖維，但形成纖維形態不均勻，無法呈現出立體圓形。
本次研究通過對 R1R2 和 R1R2CT 的表達、純化以及二級結構和成絲傾向的分析，證實了在不同 pH 值的 PBS 中 R1R2 為無規卷曲構象，而R1R2CT 則主要為螺旋構象。pH 值 6.5～7.5 不利于絲素蛋白的纖維化，pH 值為 5.5 時，纖維化形態較好。另外，我們還分析了 NaCl 對成絲的影響，結果表明 NaCl 不利于高品質纖維的形成。本研究為成絲機理的研究以及通過基因工程方法仿生蜘蛛絲奠定了基礎。
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