近年來，手性制藥工業迅速發展壯大，單一對應體藥物每年以大于 20% 的速度增長，其對手性胺的需求也隨之增長。目前，超過 70% 的藥物都是手性胺及其衍生物，如神經類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感染藥物及疫苗等的合成都是以手性胺作為中間體，抗糖尿病新藥 Janu-via 的主要成分西他列汀是 Ｒ-型胺。這就催促人們尋找一種高效制備手性胺的方法，而轉氨酶的出現使研究者看到了曙光。轉氨酶以其高選擇性、高轉化率及溫和的反應條件贏得了廣大研究者的青睞，其能夠催化 1 個氨基供體\\( 氨基酸或簡單的胺\\) 上的氨基轉移到前手性的受體酮，得到手性胺和副產物酮或者 α － 酮酸\\( 圖 1\\) ，反應過程需要磷酸吡哆醛 \\( pyridoxal phosphate，PLP\\) 的參與。
轉氨酶合成手性化合物已經發展為一項關鍵的不對稱合成技術，受到越來越受到眾多研究者的重視和關注。2013 年 2 月 28 日，第一屆國際轉氨酶生物催化研討會于瑞典斯德哥爾摩召開，鑒于此，本文作者將轉氨酶在手性化合物合成中涉及到的蛋白工程、表達與固定化、進程工程及應用方面的研究現狀予以綜述。


1 轉氨酶蛋白工程

蛋白工程是指通過改變已知蛋白的結構來改變其性質的過程，需要借助計算機和生物信息學手段來實現，是研究酶的功能及進化的重要技術，也是改變酶性質、開發新酶的重要方法。利用蛋白工程的方法對轉氨酶進行改造即為轉氨酶蛋白工程，其目的是得到有工業應用價值的酶，打通手性藥物及化工產品的酶法合成途徑。所用關鍵技術包括理性設計、定向進化以及兩者組合方法; 所涉及工具主要包括迭代飽和誘變\\( it-erative saturation mutagenesis，ISM \\) 、組合活性位點飽和測試\\( combination of active site saturationtest，CASTing \\) 、蛋白序列活性關系 \\( protein se-quence activity relationship，ProSAＲ\\) 等。隨著計算機技術以及生物信息學的快速發展，轉氨酶蛋白工程迎來了第三次浪潮，成為國內外研究熱點。
轉氨酶蛋白工程主要包括 5 個步驟: 選擇合適的模板、穩定模板、確定活性位點、活性位點周圍氨基酸殘基理性設計或定向進化、突變體活性評估。經過以上幾步，就可以根據人們的意愿將一個原本對某一底物無活性的轉氨酶變為對此底物活性很高的生物催化劑，在此方面最成功的例子當屬 Savile 等利用蛋白工程手段得到的突變型 ATA-117，其能夠用于工業化生產西他列汀。到目前為止，此酶是轉氨酶工業化應用最成功的例子，利用該酶的西他列汀生物催化合成工藝獲得 2010 年美國總統綠色化學挑戰獎。目前，國內外很多課題組都在進行轉氨酶蛋白工程的研究，近五年來，新型轉氨酶如雨后春筍般涌出\\( 表 1\\) 。

2 轉氨酶表達與固定化

轉氨酶的表達目前有 3 種途徑。第一，利用原始菌株表達，由于原始菌株表達量低及效率低下等不足，此途徑現一般只在新產酶菌株初步篩選階段使用; 第二，利用工程菌表達，此法應用最多，目前轉氨酶已經在原核與真核系統中實現表達。原核表達普遍采用大腸桿菌表達系統，例如 Iwasaki 等成功構建一種 Ｒ-型轉氨酶\\( Ｒ-TA\\) 的表達工程菌 E． coli HB101-pAT28-Ｒ-TA，通過工程菌的誘導表達可以得到大量 Ｒ-TA; Savile等構建工程菌 E. coli W3110-pCK110700-ATA-117 表達 ATA-117 及突變酶; Cassimjee 等利用工程菌E． coli BL21 \\( DE\\)-pET28-ATA-113 成功實現轉氨酶 ATA-113 的大量表達。原核表達系統是目前掌握最為成熟的表達系統，其優點在于能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而所需的成本相對低廉。但原核表達系統還存在許多難以克服的缺點，如無法對表達時間及表達水平進行調控，目的蛋白易形成包涵體，導致產物純化困難。為彌補以上不足，許多學者將原核基因調控系統引入真核基因調控領域，采用真核系統進行目標蛋白的表達。真核表達有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞三種系統，目前，轉氨酶多采用畢赤酵母表達系統，如 Bea 等成功構建了ω-TA 的真核表達系統 P. pastoris GS115-pPIC-ω-TA; Weinhandl 等通過轉氨酶基因密碼子優化，構建了能夠大量表達 ilvE 的 P. pastoris Mut-SpPpT4_S / pPpT4 _GAP_S-ilvE。真核表達系統能誘導基因高效表達，可達原始表達量的 105 倍，另外，其還能嚴格調控基因表達，是原核表達系統所不能及的，因此，利用真核表達系統來表達目的蛋白越來越受到重視，其多用于可調控的轉氨酶的大量表達。第三，通過無細胞體系表達。Kwon等建立了一種無細胞蛋白合成系統成功實現了 ω-TA 的非克隆性表達，此方法主要使用于轉氨酶的高通量篩選。
在轉化中作者通常用到 2 種酶形式: 游離酶和固定化酶。游離酶活性雖高但是只能用 1 次，且會影響產物的分離純化，而固定化酶則會大大提高重復利用率，因此成為了研究重點。轉氨酶的固定化包括固定化細胞和固定化游離酶。固定化細胞所用材料主要是殼聚糖、海藻酸鈉以及一種新型材料 LentiKats。Ｒehn 等發現利用殼聚糖固定化含有 ω-TA 的大腸桿菌細胞，在優化條件下，細胞加載量可達 3. 2 g·g－ 1殼聚糖，殘留活性大于 60%，在 1 h 的反應中，連續 8 次反應，固定化酶活性仍大于 90%。Fernandez 等利用LentiKats 固定化含有 ω-TA 的大腸桿菌細胞，其穩定性得到了提高，在連續五次合成 1-苯乙胺及3-氨基-丁苯后，殘留活性仍大于 80% 。固定化游離酶所用材料主要有聚合樹脂、溶膠/硅藻土基質、殼聚糖、硅膠。Truppo 等利用一種聚合樹脂 SEPABEAD EXE120 成功固定化西他列汀轉氨酶\\( 突變型 ATA-117\\) ，固定化酶以異丙醇為溶劑，在 200 g·L－ 1底物濃度下，重復使用 10次，連續反應 200 h，其活性并無損失。Mallin等利用優化的殼聚糖固定化兩個 Ｒ-TA，兩個固定化酶對于 1-苯乙胺的合成都有很好的活性，其中一種轉氨酶轉化在合成 Ｒ-2-己胺時，活性比游離酶提高了 13. 4 倍，轉化率大于 99%。此外，Matosevic 等利用固定化酶微反應器平臺成功實現了手性氨基醇多步生物轉化篩選過程。由以上例子可以看出，轉氨酶的固定化在提高酶穩定性、拓寬酶使用范圍以及改善酶反應條件方面都有重要意義，通過固定化，有望克服游離酶反應的過程瓶頸，實現轉氨酶工業化應用。但是固定化酶由于傳質限制，酶活性會普遍降低，同時固定化酶的制備增加了酶的成本，因此更加優越的固定化介質有待開發。

3 轉氨酶過程工程

轉氨酶催化的轉氨反應是一個熱力學平衡過程，主要包括兩個互補的反應: 手性胺的不對稱合成和外消旋胺的運力學拆分。以上兩個反應過程受反應物、產物、反應條件等因素影響，反應時所發生的平衡逆向移動是轉氨反應中的瓶頸問題。因此，要實現高效率不對稱合成就需要從影響因素入手，改變反應的平衡。眾多學者就此問題進行了深入的研究，現將解決方案歸納如下:

3. 1 加入過量的氨基供體

改變平衡的一個最簡單的方法就是加入過量的氨基供體，Savile 等在生產西他列汀時就采用了此方法: 在優化的反應條件下，向 40 mL 反應體系中加入2 － 丙胺39. 8 mmol，前西他列汀酮18. 9 mmol，此時氨基供體的量是氨基受體的2 倍; 在放大的反應體系中，加入高達 10 倍過量氨基供體，反應得到西他列汀的轉化率為 92%。
需要注意的是此種方法只適用于反應的平衡對產物產率影響不大的情況。如果平衡嚴重不利于產物的生成，而反應所需的底物質量濃度比較高\\( ＞50 g·L－ 1\\) ，氨基供體和受體按照 1 ～ 50∶ 1的摩爾比進行反應，氨基供體的過量倍數將會受到限制，加入太多的氨基供體將會出現可溶性差等其他的問題。

3. 2 副產物的自動降解

副產物自動降解是利用副產物在反應條件下自動形成另外一種非反應成分，達到解決抑制的目的。Lo 等發現以鳥氨酸和賴氨酸作為氨基供體時，反應產生的氨基酮會自動環化，使平衡向生成胺的方向移動。同樣 Truppo 等在利用轉氨酶合成 6-甲基-2-吡咯酮\\( 50 g·L－ 1\\) 的反應中\\( 圖 2\\) ，利用一級產物乙胺基丁酰乙酯的自動環化，形成非抑制性終產物 6-甲基-2-吡咯酮的反應趨勢，解除一級產物抑制，獲得終產物時轉化率大于 90%，產物 ee 值大于 99%。副產物自動降解是一種非常傳統的方法，受到副產物性質限制，其應用并不多。


3. 3 移除產物或副產物

由于產物或副產物的存在，常常會對平衡產生抑制作用，因此可以通過在反應時移除產物或者副產物的方法來改變平衡，這種方法也稱為在位產物移除\\( in situ product removal，ISPＲ\\) ，ISPＲ的效率與產物胺以及其它反應組分的性質有關。
其中產物的物理化學性質如揮發性、溶解性、帶電性、疏水性、和分子大小是 ISＲP 中研究最多的幾個方面。
實現 ISPＲ 的途徑有多種。Koszeiewski 等在利用 ATA-117 轉化 4-苯基-2-丁酮合成 Ｒ-4-苯基丁-2-胺的過程中，綜合運用有機溶劑萃取和調整pH 的方法使反應物的轉化率達到 92% ，ee 值高達 99%; Truppo 等在利用 ATA-113 和 ATA-117 轉化苯乙酮合成 α-甲基苯乙胺的過程中采用樹脂提取技術成功獲得了高達 99% 的轉化率，與之前不采用 ISPＲ 技術的轉化率 10% 相比，反應的轉化率得到了大幅度的提高。另外讓易揮發的副產物揮發掉也可以作為改變平衡的一個方法。
當以 2-丙胺或者 2-丁胺作為氨基供體時，會產生副產物丙酮或者丁酮，由于丙酮和丁酮與其它反應物相比具有較低的沸點，因此可以通過減壓使副產物揮發掉，這樣轉氨反應就趨于完全。此外對于易揮發的胺還可以通過蒸餾的方法進行產物回收，這種方法多用于動力學拆分。

3. 4 酶偶聯反應

酶偶聯反應是指將轉氨反應與其它酶促反應聯合使用，將副產物\\( 丙酮酸或者丙酮\\) 轉化為非反應成分或者原始的底物。此方法是到目前為止研究和應用最多的提高不對稱合成產率的途徑，表 2 對常用的酶級聯反應進行了總結。Cassimjee等用來自 A. citreus 的具有 S-選擇性的 ω-轉氨酶作為催化劑，以異丙胺為氨基供體，在催化苯乙酮合成 S-1-苯乙胺的反應\\( 圖 3\\) 中引入平衡置換系統: YADH/FDH\\( yeast alcohol dehydrogenase/formate dehydrogenase\\) ，其中 YADH 將生成的丙酮轉化為 2-羥基丙醇，FDH 再生輔因子 NADH\\( nicotinamide adenine dinucleotide plus hydro-gen\\) ，驅動反應正向進行，成功獲得高達 99% 的產率和 99. 9% 的 ee\\( enantiomeric excess value\\)值，未引入平衡置換系統的反應轉化率只有60% ～ 80% 。Schatzle 等利用七種 Ｒ-型轉氨酶合成 Ｒ-胺時，引入 LDH/GDH\\( lactate dehydro-genase / glucose dehydrogenase\\) 系統，通過優化反應條件，使得產物產率高達 99%。其中 LDH 將丙酮酸轉化為 2-羥基丙酮酸，GDH 用來再生輔因子 NADH，轉氨酶聯合 LDH/GDH 達到了高效合成手性胺的目的，此外在以上兩個反應體系中，由于使用輔因子再生系統，在一定程度上降低了反應的經濟成本。Truppo 等在轉氨酶 ATA-117拆分外消旋苯乙胺的反應體系中加入 D-氨基酸氧化酶，實現了丙酮酸再生，同時反應的平衡也發生了移動，反應 1 h，轉化率可達到 50%，\\( S\\) -1-苯乙胺 ee 值高于 90%，而之前反應 1 h 轉化率只有 7. 5%，產物 ee 值只有 8%。由此可見利用酶偶聯反應可以大大提高不對稱合成以及動力學拆分的產率，對于小規模制備來說是一種高效可行的方法。


合理的酶反應系統是獲得高轉化率的保證。酶的性質、反應體系中各成分的相互作用、輔因子的加入量等都會影響反應效率，比如在 FDH 體系中加入高濃度的甲酸鹽會影響其它酶的活性和穩定性。Santacoloma 等對酶級聯反應相關問題做了詳細的討論。酶級聯反應的效率雖然很高但是其經濟成本很高，不適合大規模制備。一個替代途徑就是用全細胞作為催化劑。利用生物技術的方法實現目標酶在宿主菌中共表達，利用全細胞進行催化。Yun 等利用可以共表達 ω-TA和乙酰乳酸合成酶的 Ecoli 全細胞作為催化劑，成功合成了 S-α-甲基苯胺，Bea 等利用含有ω-TA 和內源性氧化還原酶的重組畢赤酵母為催化劑，成功拆分 α-苯乙胺，ee ＞ 99%，轉化率達52. 2% 。此外，Wang 等開發了一種新的單酶級聯反應體系，用 ω-TA 催化高效不對稱合成手性胺，克服了多酶級聯反應的成本高、酶不兼容等缺點，但是此方法目前并不能用于手性胺的大量生產。

4 轉氨酶應用

轉氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸、手性氨基醇等的合成，這些手性化合物在制藥工業、農業、化工業都有重要的作用，其常作為藥品的活性成分或主要中間體被使用。目前，立體選擇性的合成以上手性化合物主要是通過化學法實現，如大家熟知的不對稱還原 Stiff 堿，但是化學法存在一些不足，如反應條件苛刻、運用有毒的過渡態金屬催化劑等，有時候在單一的催化反應中得不到足夠的立體選擇性，引起了一系列的環境問題，產品也不符合藥物要求。然而利用轉氨酶催化制備相應的手性化合物反應條件溫和、過程簡單、立體選擇性高，逐漸取代了一些化學步驟。利用酶法、化學-酶法合成含手性胺的活性藥物以及小分子手性胺非常具有發展前景。下面從四個方面介紹轉氨酶在合成手性化合物中的應用。
4. 1 合成手性胺

手性胺是合成許多手性藥物的重要中間體，也是含氨基的光學純藥物的主要成分。神經類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感染藥物及疫苗等都是以手性胺作為中間體; 而抗糖尿病新藥Januvia 的主要成分西他列汀是 Ｒ-型丁二胺。
在手性胺的合成中兩者同樣重要。下面逐一介紹。
a． 不對稱合成，是指在合適的氨基供體\\( 如異丙胺，L-丙氨酸\\) 存在下，轉氨酶催化前手性酮生成相應的手性胺的過程。其又可細分為兩類，酶一步合成法和化學 － 酶合成法。例如，Savile等利用突變型 Ｒ － 轉氨酶 ATA － 117 不對稱合成西他列汀，經過一步反應，成功得到西他列汀，實現了西他列汀 200 g·L－ 1的工業化生產，24h 轉化率 ＞ 95% ，ee ＞ 99. 5% \\( 圖 4\\) ; Fuchs 等成功采用化學酶法全合成得到\\( S\\) -利斯的明，其首先利用 ω 轉氨酶合成所需的前體 1-苯乙胺，并利用酶偶聯反應解決平衡移動問題，后利用化學法合成其余基團\\( 圖 5\\) ，經過四步反應，整體收率達 71%，ee ＞99%。以上例子的成功都是非常激動人心的，但由于反應的可逆性，其轉化率理論不能達到 100%，因此，解決平衡移動問題仍然是今后需要深入研究的。

c． 工業應用情況: 一個生物催化劑要應用到工業 生 產 中，其 底 物 質 量 濃 度 至 少 應 達 到50 g·L－ 1，因此大部分轉氨酶，由于底物濃度、反應溫度、有機溶劑耐受性等眾多因素的限制目前只停留在實驗室階段。近幾年轉氨酶在工業應用最成功的例子當屬突變型 ATA-117，其能夠用于西他列汀的工業生產。除此外，其他小分子胺的生產也達到了工業要求，如 Truppo 等采用轉氨酶與 LDH 偶聯以及離子交換樹脂在位移除產物兩種方法，成功實現了 Ｒ/S 甲基苯乙胺以及 Ｒ/S 6-甲基-2-哌啶酮 50 g·L－ 1的高效生產，其收率 ＞ 90，ee ＞ 99%。表 3 對近幾年利用轉氨酶生產手性胺的情況進行了歸納總結，由此可見轉氨酶在制備手性胺方面具有較大的應用潛力和開發價值，是目前及未來的研究熱點。

4. 2 合成手性氨基酸

光學純的氨基酸在生物體內起著舉足輕重的作用，同時在制藥工業有著重要的作用。很多 α-和 β-氨基酸及其衍生物是生物體內關鍵的神經遞質，如谷氨酸鹽、γ-氨基丁酸; 而很多非蛋白氨基酸則在生物次級代謝過程中有重要作用，圖 7對含氨基酸的藥物進行了總結。2008 年之前，開發有藥學活性的光學純氨基酸吸引了眾多藥學家的眼球，利用轉氨酶制備芳香族 β-氨基酸、L-α-氨基酸，脂肪族 L-α-氨基酸以及 D-氨基酸、15N 標記的氨基酸等層出不窮，Hohne 等對此進行了綜述。
到目前為止，生物催化法制備手性氨基酸最成功的例子為 L-高苯丙氨酸的制備。L-高苯丙氨酸是制備血管緊張素轉換酶\\( ACE\\) 抑制劑藥物的重要原料，它是目前世界上約 20 種抗高血壓新藥的共同中間體，如依拉普利、地拉普利、西拉普利等。目前用于制備手性氨基酸的轉氨酶種類很多如酪氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、ω － 轉氨酶等。Lo 等用工程化的大腸桿菌天冬氨酸轉氨酶高效制備了 L-高苯丙氨酸。Min 等用固定化的消旋酶及氨甲酰水解酶由相應底物制備L-高苯丙氨酸，此固定化酶可重復利用 14 次，實現了轉氨酶的重復高效利用，更有利于工業化應用。

4. 3 合成手性氨基醇

手性氨基醇結構中含有手性氨和手性醇，是一類更有價值的生化試劑及藥物中間體，如抗病毒糖苷酶抑制劑、鞘脂類藥物，廣譜抗生素氯霉素、甲砜霉素等眾多藥物中均含有手性氨基醇。目前生產手性氨基醇的方法有化學法和生物催化法 2 種，相對于化學法，生物催化法更加綠色、高效，因此便成為研究熱點。
生物催化法制備手性氨基醇主要由有 3 種途徑: a． 酮還原酶或轉酮醇酶與轉氨酶偶聯，轉化底物酮生成手性氨基醇; b． 轉氨酶轉化手性酮醇為手性氨基醇; c． 酮還原酶轉化手性氨基酮為手性氨基醇。由此可見，轉氨酶在手性氨基醇的合成中起著舉足輕重的作用，利用轉氨酶制備手性氨基醇也越來越受到化學家的親睞。Smith等設計了一種簡潔的合成手性氨基醇的方法: 轉酮醇酶和 ω-轉氨酶偶聯，通過兩步反應，成功制得\\( 2S，3S\\) -2-氨基戊烷-1，3-二醇，此法可以實現\\( 2S，3S\\) -2-氨基戊烷-1，3-二醇制備規模的生產。
Smithies 等利用 C． violaceum ω-轉氨酶成功將1，3-二羥基-1-苯丙基-2-酮轉化為\\( 2S\\) -2-氨基-1-苯基-1，3-丙二醇，而此酶對外消旋 1，3-二羥基-1-苯丙基-2-酮并無選擇性\\( 圖 8\\) ，因此其用于轉化底物酮醇制備手性氨基醇非常理想。雖然以上例子均令人欣喜，但是能夠高效制備手性氨基醇的轉氨酶種類并不多，尤其是能用于工業化生產的更是少，因此，新的酶以及更優的反應條件亟待開發。


4. 4 合成含氘氚標記的手性胺

放射性氘、氚標記的化合物對于了解藥物代謝和藥物動力學有重要作用。氘氚標記的藥物在臨床前研究中，有利于研究者理解藥物的吸收和分布，對提高其活性有重要指導意義。傳統方法是從含氘氚標記的底物直接合成手性胺，而Truppo 等通過向反應體系中加入氘、氚的方法直接由前手性酮制備得到了多種重氫標記的手性胺，如含氘西他列汀的制備\\( 圖 9\\) 。在 60% 的氘水和 40% DMSO 溶 劑 中，經 過 20 h 轉 化，20 g·L－ 1的底物有 82% 轉化為含氘西他列汀，此西他列汀中所有氫均被置換為氘。利用轉氨酶CDX-017 制備氚標記的 N-Cbz 吡咯胺，在優化的反應條件下，經過 2 d 反應，N-Cbz 吡咯胺中氚的富集程度達到 280%，明顯高出統計值 100%。以上例子說明轉氨酶同樣可以用于催化前手性酮制備多種重氫標記的手性胺，其過程簡單可操作性強，是今后的發展趨勢。


5 結語

近年來，轉氨酶在手性化合物合成中得到了廣泛應用，其憑借綠色、高效的合成優勢吸引了無數化學家的關注，人們采用化學 － 酶法結合的手段制備得到了大量手性胺。近五年來，從轉氨酶蛋白工程、表達、固定化、進程工程到應用，國內外研究者都投入了大量的精力，也得到了很多可喜的成果。但是目前能夠用于工業化生產的轉氨酶并不多，因此新型酶的篩選以及反應條件的優化仍然是目前利用轉氨酶合成手性化合物面臨的兩大挑戰。開發新酶、改造現有酶以及研究轉氨酶過程工程等工作仍將是研究者們今后的研究重點，作者希望開發出更多可用于工業化生產的轉氨酶，以期搭建起手性胺的生物催化生產平臺。

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