Rab蛋白是小分子GTP結合蛋白家族 \\(由Ras、Rho/Rac/Cdc42、Ran、Sar/Arf、Rab等亞家族組成\\)中最大的亞家族,由Novick等于1980年首先發現.研究表明,Rab存在于所有的真核生物中,在進化過程中高度保守,但在不同物種中又表現出數量和功能多樣性.目前,在人類已發現約70種Rab蛋白和Rab樣蛋白.
Rab蛋白由200個左右的氨基酸組成,是一種單體形式的GTP結合蛋白.Rab蛋白由保守的G結構域和高度可變的N端和C端組成,其家族成員的氨基酸序列的相似性在35%~80%之間.Rab蛋白在體內有兩種構象:與GTP結合的Rab蛋白處于活化的狀態,位于胞膜;未活化的Rab蛋白與GDP結合,位于胞漿.
作為囊泡運輸的分子開關,Rab蛋白在非活化和活化狀態之間不斷轉換,在囊泡的形成、轉運、粘附和融合過程中起重要作用.Rab蛋白可直接或間接與被運輸的分子結合,使其進入囊泡.
Rab蛋白能聚集于細胞內特定的膜區,通過吸附不同的效應因子而實現與靶膜的結合.
最近幾年的研究表明,一些Rab蛋白通過囊泡運輸參與細胞內信號傳導,調節細胞的增殖、分化和凋亡,而有些Rab蛋白甚至直接影響DNA的復制與轉錄.
Rab7屬Rab蛋白家族,在早期內體到晚期內體以及晚期內體到溶酶體的膜泡轉運中發揮重要的作用.
本論文將人類Rab7基因克隆到原核表達載體,通過誘導基因工程菌獲得Rab7蛋白,并以此為抗原免疫小白鼠,獲得人Rab7多克隆抗體,為進一步研究Rab7的生物學功能奠定基礎.
1 材料與方法
1.1 材料
Tripure Isolation Reagent購自Roche公司,M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit為TaKaRa公司產品,質粒DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Omega公司,Glutathione Sepharose 4B、ProteinAagarose購自GE公司,異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷\\(IPTG\\)購自Sigma公司,表達質粒pGEX-4T-2和大腸桿 菌DH5α菌 株 由 本 實 驗 室 保 存,引 物1:5’AAGGATCCATGACCTCTAGGAAGAAAG 3’\\(BamHI\\)和引物2:5’AAGAATTCGCAACTGCAGCTTTCTGCC 3’\\(EcoRI\\)由生工上海有限公司合成,Taq DNA聚 合 酶、dNTP、EcoRⅠ酶、BamHⅠ酶、T4DNA連 接 酶、蛋 白 質 標 準marker購 自Ferments,DNA marker購自上海生工,其他試劑均為國產分析純.
1.2 方法
1.2.1人腎胚細胞HEK293RNA的提取與逆轉錄將培養瓶中培養的HEK293細胞吸去培養基,直接加入1mL的Tripure,吹打幾次使細胞完全裂解,然后轉入1.5mL的Ep管中,根據使用說明提取總RNA,然后用50μL的經DEPC處理的滅菌去離子水溶解.取4μg總RNA,根據M-MLV ReverseTranscriptase的說明進行逆轉錄獲得HEK293細胞的cDNA.
1.2.2 Rab7基因的重組表達常規方法擴增Rab7基因,PCR擴增條件為:94 ℃預變性3min,94 ℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,共38個循環,再于72℃繼續延伸10min.PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,回收目的片段.
用EcoR I,BamH I酶切PCR產物和pGEX-4T-2質粒,然后回收酶切產物,在24℃下用T4DNA連接酶連接30min,連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞,涂到含氨芐青霉素的LB固體培養基平板上培養16h,菌落PCR方法挑選陽性克隆,PCR條件同上.
選取陽性克隆培養,提取質粒,通過雙酶切法進一步檢測,陽性菌落送生工測序.
檢測與測序正確的菌株接種到5mL含氨芐青霉素的LB液體培養基中,37 ℃下振蕩培養過夜,第二天按1∶50的比例接種到新鮮的培養基中培養至生長對數期\\(約4h\\)后取出,放至室溫后加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半苷\\(IPTG\\),誘導劑的終濃度為0.25mmol/L的,然后將不同的菌液分別在不同溫度下繼續搖培4~6h進行目基因的誘導表達.
離心法收集菌體,菌體用冰冷的PBS重懸,超聲破碎裂解細菌,10 000× g離心10min,對離心后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析.
1.2.3 Rab7重組蛋白的純化將含重組質粒的DH5α菌接種于500mL LB液體培養基,加入IPTG后在24℃繼續搖培6h.離心收集菌體,加入預冷的15mL 1×PBS緩沖液,冰上超聲裂解細菌.裂解液4℃下10 000× g離心20min,將離心后的上清液與Glutathione Sepharose 4B結合30min,將結合液裝到層析柱上,用1×PBS洗去雜蛋白,然后用洗脫緩沖液\\(50mmol/L Tris-HCl,10mmol/L GSH,pH8.0\\)洗脫目的蛋白.通過SDS-PAGE法鑒定融合蛋白的純度,用Bradford法測定蛋白質濃度.
1.2.4 Rab7多克隆抗體的制備取抗原200!g,加入弗氏完全佐劑\\(后3次用不完全佐劑\\)振蕩混合4~6h至抗原完全乳化.選取10只7~12周的BALB/c雌鼠進行免疫注射,共注射4次,每次間隔10d.最后一次注射后第4天采血,用1.5mL Ep管收集鼠血,放置在4 ℃冰箱中過夜.第二天,4 ℃ 2 000g離心10min,吸取血清,分裝成小管放在-80℃冰箱中保存.使用時用Protein A agarose親和柱分離抗血清中的IgG.
1.2.5 酶聯免疫分析\\(ELISA\\)設置正常處理\\(抗原+抗體+二抗\\)、陽性對照\\(稀釋二抗+底物溶液\\)、陰性對照\\(抗原+其他小鼠抗體+二抗\\)三組反應,按ELISA法常規操作,鑒定Rab7多克隆抗體的特異性和滴度.
2 結果與分析
2.1 Rab7基因的克隆與表達從NCBI獲得Rab7\\(NM_004637.5\\)基因的cDNA序列,以HEK293細胞的總RNA逆轉錄出來的cDNA為模板,用Rab7基因的特異性引物擴增,擴增產物通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,可以在凝膠上看到600bp左右的條帶,與預想的PCR產物大小相符合.PCR產物經常規的操作步驟,構建出重組質粒pGEX-4T-2-Rab7,然后轉化大腸桿菌E.coli DH5α感受態細胞,菌落PCR擴增出與預期結果大小一致的特異性條帶\\(圖1\\).【圖1】
對該重組表達質粒進行雙酶切鑒定,也得到一條長約600bp的條帶,與預期大小一致,說明Rab7基因已克隆到表達載體上,對酶切鑒定正確的陽性克隆進行測序,使用DNAMAN軟件比較此次克隆到的序列和NCBI上的序列,結果表明序列結果正確,沒有移碼或突變,表明原核表達載體成功構建.SDS-PAGE電泳結果表明,經IPTG誘導表達的重組菌出現一條非常明顯的誘導蛋白條帶,條帶大小在48kDa\\(圖2,箭頭所示\\),此帶的大小與Rab7蛋白及與其融合的GST蛋白的分子量\\(28kD\\)之和大致相當.【圖2】
但在對照組\\(未經IPTG誘導的重組菌株\\)中看不到該蛋白條帶,說明Rab7基因插入表達載體pGEX-4T-2后,在大腸桿菌中獲得了高效表達.但在37 ℃下誘導形成不可溶的包涵體.改變誘導溫度,發現融合蛋白在24℃條件下部分可溶.選擇24 ℃作為誘導溫度,重組菌經IPTG誘導4h后離心收集菌體,超聲波破碎,GlutathioneSepharose 4B親和層析純化.
純化的重組蛋白進行SDS-PAGE分析以鑒定其純度,結果在凝膠上只有一條48kDa大小的條帶,說明獲得了純度很高的重組融合蛋白\\(圖3\\).【圖3】
2.2 Rab7多克隆抗體的制備與檢測用純化的重組表達融合蛋白作為抗原免疫小鼠以獲得抗體,然 后 再 用Protein A agarose親 和 柱 分 離 純 化IgG.采用ELISA方法來檢驗抗體的特異性和滴度,用純化的融合蛋白包被ELISA滴定板,將純化的IgG梯度稀釋后做ELISA鑒定,測定OD450,取2次實驗的平均值\\(圖4\\).【圖4】
由圖可見,將抗體稀釋20 000倍后,在450nm處仍有光吸收,即抗體滴度可達1∶20 000,同時,吸收峰在抗體稀釋500倍最高,說明抗體的最佳工作濃度\\(即OD450最高處\\)約為1∶500.而陰性對照并無明顯反應.
由此說明所制備的抗體特異性和滴度都是合格的3討論有研究發現Rab7在早期內體到晚期內體以及晚期內體到溶酶體的膜泡轉運中發揮了重要的作用.Rab7還可以通過促進溶酶體的運輸還可以清除胞內病毒,Rab7還參與了受體的轉運,如將血管緊張素受體表皮生長因子受體轉運到溶酶體降解.
研究還發現Rab7參與了天然免疫中TLR信號通路.曹雪濤等發現Rab7在Toll樣受體4\\(Toll-like receptor 4,TLR4\\)信號途徑中的重要作用,Rab7促進TLR4轉移至溶酶體降解.王娜等發現Rab7抑制了CpG刺激的巨噬細胞中IL-6、IL-1、IFN的表達,該抑制作用的發揮與其酶活性的GTP結合有關,說明Rab7參與了CpG/TLR9信號通路.鑒于Rab7在細胞中的重要作用,本研究旨在獲得Rab7的抗體,為后續研究做些鋪墊.通過常規的克隆與表達方法,并通過優化誘導條件,本研究獲得了純化的Rab7蛋白,并以此免疫小白鼠,制備了具有良好特異性和較高滴度的抗體.
