蛇毒是由毒蛇毒腺分泌的一類天然毒液,含有多種蛋白質、多肽、酶類和其它小分子物質,具有廣泛地生物學活性,常作為天然藥用資源庫進行研究。隨著藥理學、毒理學和藥物學的發展,蛇毒酶類在抗血栓、止血、鎮痛、降壓及抗腫瘤方面表現出很大的潛力。根據酶活力中心特點,蛇毒酶類分為絲氨酸蛋白酶類和金屬蛋白酶類; 根據活性功能分為蛋白水解類、抗凝血類、促凝血類和激肽釋放類。其中蛇毒類激肽釋放酶,是與激肽釋放酶性質相似的一類絲氨酸蛋白酶的總稱,能作用激肽原生成激肽,具有擴張血管,改善微循環和調節血壓等作用; 同時還可以作為活化因子,激活纖溶酶原,提高纖溶系統和膠原水解酶活性,起到防止血凝,抗血栓形成,該酶對開發為心腦血管疾病治療藥物具有重要的應用前景。目前對蛇毒類激肽釋放酶的綜述報道尚屬空白,本文就其分布、分離制備、生化性質、藥效研究以及此領域的研究進展等做一詳細綜述,為今后蛇毒類激肽釋放酶的研究提供參考依據。

1、 蛇毒類激肽釋放酶的分布

1948 年,Rocha 等首次在矛頭腹 Bothrops jarara-ca 蛇毒中發現了類激肽釋放酶,與血液共同孵育時表現為一種平滑肌舒張物質,而將其注入動物體內會引起血壓的下降,此后激肽釋放酶廣泛在哺乳動物的血漿和胰臟等腺體組織中發現。迄今為止,研究人員已經在響尾蛇屬、腹亞科、蝰亞科和眼鏡蛇科等種屬的30 余種毒蛇蛇毒中都分離得到了類激肽釋放酶。Os-hima 等根據精氨酸酯酶及類激肽釋放酶的活性,指出類激肽釋放酶在腹亞科蛇毒中的活力最高。Abdus-alam 等研究了響尾蛇屬、蝰亞科、眼鏡蛇科等 15 種毒蛇蛇毒的激肽酶、酪氨酸酯酶、精氨酸酯酶及激肽釋放酶的活性,指出所有響尾蛇屬和蝰亞科蛇毒中都含有類激肽釋放酶的分布,而在蝮亞科 Agkistrodon halysussuriensis 中活性較高,與前人研究結果一致。

2、 蛇毒類激肽釋放酶的分離純化及制備

傳統的蛇毒酶類主要采用色譜法進行分離純化,類激肽釋放酶也是如此,包括離子交換色譜法和凝膠過濾色譜法,并結合親和層析輔助純化完成。常用的陰離子交換劑有 DEAE-葡聚糖凝膠和 DEAE-纖維素等,葡聚糖凝膠有 SephadexG-100 和 SephadexG-75 用作分離。隨著分子生物學的發展,利用基因工程技術對蛇毒酶類進行重組表達的技術越來越成熟。目前已有多種蛇毒酶類獲得了具有活性的重組表達產物,如來自南美洲矛頭蛇毒中的降纖酶和止血酶 Batroxobin,菜花烙鐵頭蛇毒中的纖溶酶 Jerdonitin 和綠蝮蛇毒中的抗血小板凝集的金屬酶 Albocollagenase 等。

相應的,蛇毒類激肽釋放酶的重組表達也有相關研究。Huang 等將烙鐵頭蛇毒激肽釋放酶基因與兩個限制性內切酶切位點 BamH I、Pst I 和組氨酸標簽基因構建克隆到載體 pQE30 后,轉入 E. coli M15 中進行原核表達,表達產物經免疫雜交、液相色譜分析、電噴霧質譜和 N 端氨基酸分析驗證,結果表明重組表達類激肽釋放酶 Tm-5 與天然烙鐵頭蛇毒激肽釋放酶結構一致,且對天然 Tm5 的底物 N-benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilide 具有很高的活性,表明重組類激肽釋放酶Tm 表達成功。Wang 等首次報道了將江浙蝮蛇蛇毒類激肽釋放酶基因克隆到 pCS2 +表達載體后,轉入小麥麥胚無細胞表達系統進行表達,通過對載體、RNA聚合酶濃度、磷酸肌酸和 Cu2 +等條件的優化,表達的重組表達激肽釋放酶活性為 1. 3 U/mg,能達到天然蛇毒激肽釋放酶活性\\( 1. 74 U/mg\\) 的 75%,得到了具有相對高活性的無細胞表達的類激肽釋放酶,為無細胞表達載體的應用前景提供了依據。

3、 蛇毒類激肽釋放酶的生化性質研究

哺乳動物體內有兩種激肽釋放酶: 組織型激肽釋放酶和血漿型激肽釋放酶。組織型激肽釋放酶作用于高分子量激肽原和低分子量激肽原,均釋放胰激肽,血漿型激肽釋放酶只作用高分子量激肽原釋放緩激肽。大部分來自腹亞科和響尾科蛇毒的激肽釋放酶與血漿型激肽釋放酶特異性一致,只作用于高分子量激肽原釋放緩激肽,然而來自原矛頭蝮屬毒蛇蛇毒的 elegaxo-binⅡ與組織型激肽釋放酶特異性一致,能夠分別作用于高分子量和低分子量激肽釋放胰激肽。激肽釋放酶在哺乳動物體內都是酶原形式存在的,要經蛋白酶作用后剪切,去掉氨基端的 6 個氨基酸殘基形成活性形式后才能發揮生物活性,而蛇毒類激肽釋放酶與其不同,不需要激活,直接可以用于激肽原釋放激肽,引起下游的生物學反應。

目前發現的類激肽釋放酶均屬于單體糖蛋白,分子量約為30 ~35 kD。糖鏈結構主要有海藻糖、己糖和唾液酸等,其所占蛋白分子量的比例均有不同,來自Agkistrodon caliginosus 類激肽釋放酶的糖鏈比重為10. 1%,而來自 Agkistrodon halys Pallas 的糖鏈為23. 3%。目前糖鏈結構對類激肽釋放酶作用機制的影響不是很明確,可能會對蛋白結構起穩定作用,而在某些酶如 LV-Ka 中,通過糖苷酶 F 去除所有糖鏈時,其失去了 90% 酰胺酶的活性,表明糖鏈結構直接參與了底物分子的識別,但是對其精確的糖鏈結構及相關作用機制尚未有報道。

許多蛇毒類激肽釋放酶同時具有兩種或兩種以上的酶活力,如來自響尾蛇屬的 Taiwan habu 蛇毒中的纖溶酶同時具有激肽釋放酶活性,蝰亞科的 Bothropsjararacussu 蛇毒中的 BjussuSP-I 同時具有凝血酶、促凝血酶和激肽釋放酶 3 種活性,自 Crotals mantes 的crotalase,竹葉青屬 Trimeresurus elegans 蛇毒中的 eleg-axobin II 都同時具有凝血酶和類激肽釋放酶活性,而 LV-Ka 除對 S-2302 和 S-2266 具有特異性,研究也發現當將其與纖溶酶原孵育時會對底物 Tos-Gly-Pro-Lys-pNA 水解,說明其兼有激活纖溶酶原活性,而對凝血酶底物 S-2238 和纖溶酶底物 Tos-Gly-Pro-Lys-pNA 不具有酶解活性。蛇毒類激肽釋放酶對激肽釋放酶底物 S-2302 和 S-2266 均具有較高的特異性和酶活性,同時對甲苯磺酰精氨酸甲酯\\( TAME\\) 和苯甲酰精氨酸乙酯\\( BAEE\\) 也具有水解活性,并可被二異丙基氟磷酯\\( DFP\\) 和苯甲基磺酰氯\\( PMSF\\) 所抑制,也顯示其作為一種絲氨酸蛋白酶的本質。

4、 蛇毒類激肽釋放酶的結構研究

迄今為止,科學家研究報道了近 10 種蛇毒類激肽釋放酶的全部或部分氨基酸序列,包括來自蝮蛇 Agkis-trodon caliginosus 蛇毒的 KR-E-1,江浙蝮蛇 Agkistrodonhalys pallas 蛇毒的 AHP-Ka,矛頭蝮蛇 Bothrops jararaca蛇毒的 BjussuSP-I,花蝮蛇 Agkistrodon halys blomhoffii蛇毒的 Halystase,以及來自響尾蛇屬 Prairie rattlesnake蛇毒和蝰亞科 Aspic viper 蛇毒中的類激肽釋放酶,相對于蛇毒中的類凝血酶、類纖溶酶和神經毒素等活性蛋白的報道,類激肽釋放酶的研究相對薄弱一些。Matsui 等首次報道了從花腹蛇毒中分離得到的類激肽釋放酶\\( Halystase\\) 的完整氨基酸序列,其與激肽釋放酶的同源性為 42%,與凝血酶為26% ,與蛇毒類凝血酶為 66% ~ 72% ,并表現出一些溶血纖蛋白原的活性,優先作用于血纖蛋白原 B 鏈的Arg4 位,并能緩慢降解 A 鏈,但不生成血纖肽 A 或 B,不能形成正常的血凝塊,因此 Halystase 誘導了降低血壓和阻礙血液凝固兩個作用。Sant,Ana 等對 Both-rops jararaca 蛇毒的 BjussuSP-I 的分子特性進行分析,表明 BjussuSP-I 具有其它蛇毒絲氨酸蛋白酶家族的保守序列,并有利證明了酶分子的糖鏈對于其活性發揮重要作用,而且會成為蛇毒來源酶類物質生物活性優化的最重要特性。Oyama 等[27]對 Agkistrodon caligino-sus 蛇毒的 KR-E-1 的氨基酸序列進行詳細分析,結果表明其包含 235 個氨基酸,具有絲氨酸蛋白酶家族的保守序列\\( His57,Asp102,and Ser195\\) ,在 36 號氨基酸位置具有 N 連接糖基化位點。KR-E-1 的氨基酸序列與組織激肽釋放酶,牛凝血酶 β 鏈,KN-BJ 2,elegaxobin和 elegaxobin II 的同源性分別達到了32%、31%、65%、65% 和 67% 。1 ~ 50 號氨基酸都屬于疏水性氨基酸,73 ~ 101 號氨基酸包含許多賴氨酸殘基,而此特征是此酶與其它蛇毒絲氨酸蛋白酶和人類激肽釋放酶的不同之處。在其一級結構序列中,酶活力中心 Ser195之前有 6 個天冬氨酸殘基,這種保守序列也同樣出現在以上 5 種酶的一級結構序列中,這都表明它們都具有胰蛋白酶家族的特異性。

研究人員對蝰亞科和腹亞科蛇毒絲氨酸蛋白酶研究發現: 1\\) 具有高度的序列相似性,其催化中心的 3 個氨基酸殘基 His57,Asp102和 Ser195有一致的幾何學定位; 2\\) 一級序列同源性高,N 末端通常為 V-X-G-G-D-E-C-N-I-N-E-H; 3\\) 分子中都存在 12 個半胱氨酸形成的 6 個二硫鍵,分別位于 Cys22 - Cys157,Cys42 -Cys58,Cys92 - Cys245,Cys136 - Cys201,Cys168 -Cys182,Cys192 - Cys157; 4\\) 活性中心外第 59 ~ 68,93~ 101,169 ~ 180 號氨基酸是 3 個高度變異的可變區,但這些區域的功能尚不明確,但該差異造成了類激肽釋放酶、類凝血酶和類纖溶酶等蛇毒酶底物專一性的差異,進一步體現為生物學和藥理學功能的差異。

5、 蛇毒類激肽釋放酶的藥理藥代研究

相對于已經廣泛應用于治療凝血和血栓性疾病的蛇毒酶類藥物如類凝血酶和類纖溶酶,蛇毒類激肽釋放酶的藥理藥代研究相對薄弱,主要集中在促進細胞增殖和改善血液微循環等研究方面。楊壯來采用白眉蝮蛇毒激肽原酶研究對腦缺血再灌注大鼠模型進行研究,結果表明蛇毒激肽原酶能明顯增加腦缺血再灌注大鼠缺血區血管上皮細胞的表達,促進血管的增生,從而對缺血區的神經再生和神經保護發揮重要的作用。伊力哈木江 - 依馬木等采用白眉蝮蛇毒激肽原酶研究對糖尿病大鼠模型的血液學變化,結果顯示蛇毒激肽原酶能明顯降低糖尿病大鼠的全血黏度以及血小板的聚集率,表明蛇毒激肽原酶具有減少紅細胞聚集,降低血液黏滯度,改善血瘀癥狀和紅細胞變形能力,改善血管病變,而達到防治糖尿病血管病變的作用。Zhou 等利用雙抗夾心 ELISA 方法對 Agkistr-odon halys pallas 蛇毒中的 AHP-Ka 在 SD 大鼠中的藥代動力學進行研究,結果表明其在 SD 大鼠血漿中的半衰期約為 56 min,代謝趨勢符合一室開放模型,揭示了AHP-Ka 在 SD 大鼠血漿中的藥代動力學特點和代謝趨勢,為后期 AHP-Ka 進行臨床前藥代動力學研究提供了理論參考。而近年來,人組織激肽釋放酶的藥效研究主要集中在腦缺血及腦缺血再灌注、腦梗塞、心肌缺血再灌注等病癥中的促進血管再生和減少神經細胞死亡等方面,這為將來蛇毒類激肽釋放酶重點集中于研究促進血管再生、神經細胞發生以及改善微循環等藥理藥效的研究方向提供了參考依據,為進一步研究其藥理藥效作用奠定了基礎。

6、 蛇毒類激肽釋放酶研究的展望

蛇毒是一類天然的藥用資源庫,含有多種特異性的活性多肽和蛋白類物質。目前臨床上有很多藥物都是根據蛇毒活性成分的作用機制來進行設計和應用的,如 Cushman 和 Ondetti報道的降壓藥物卡托普利,根據巴西箭頭毒蛇 Bothrops jararaca 蛇毒中一種活性多肽的降壓機制而研制; 抗凝血劑 Integrilin,根據美國東南響尾蛇 Sistrurus miliarus barbouri 蛇毒的一種活性酶而研制,目前都已經廣泛應用于臨床治療上。

還有一些正在進行臨床研究的候選藥物,如澳大利亞昆士蘭大學的研究人員正在對來自 Australian elapidvenoms 蛇毒中的 3 個針對心腦血管疾病的候選藥物:

Textilinin-1,Haempatch 和 CoVase 重點進行臨床前應用研究,開發成功后將會為心腦血管疾病領域的治療增加一類新藥。由此可見,蛇毒中的活性成分都極其具有開發為臨床治療藥物的潛能,為相關疾病的治療帶來新的希望。而目前關于蛇毒類激肽釋放酶的研究主要集中在酶學性質和結構鑒定等方面,對藥理、藥效和藥代性質的研究相對比較薄弱,這為蛇毒類激肽釋放酶開發為新藥提供了巨大的潛力和發展空間,為治療心腦血管疾病帶來新的治療前景。

常規的分離純化技術得到的蛇毒酶類純度不高,且蛇毒酶類的性能會受到地域、氣候、毒蛇養殖條件和不同批次蛇毒分離純化條件的影響,使得酶制劑的性能不均一而影響蛇毒酶類深入的研究和發展。隨著分子生物學的快速發展,利用基因工程技術將研究手段從蛋白質水平轉向分子水平,通過克隆蛇毒酶類基因,轉入表達載體進行表達,而隨著對改進表達系統,產物蛋白復性、后修飾及對宿主毒性,提高表達量和生物活性等研究方面的深入,都使得利用基因工程手段表達制備具有活性的重組蛇毒酶類成為未來的研究方向,也是制備蛇毒類激肽釋放酶的研究方向,這會使天然蛇毒資源和產品純度的問題得到解決,為更深入地研究其藥理藥效作用機制提供豐富的物質來源。

隨著分子生物學和基因工程等生物技術的飛速發展,相信蛇毒類激肽釋放酶的研究會越來越深入,更能廣泛地應用于基礎研究并在臨床醫學上發揮重要治療作用。