放線菌是一群革蘭陽性、G+C%含量高達55%的細菌，屬原核生物類群，在自然界中分布很廣，因其菌落呈放線狀而得名。放線菌與人類的生產和生活關系極為密切，目前廣泛應用的抗生素約70%是由各種放線菌產生。一些種類的放線菌還能產生各種酶制劑，如細胞色素P450酶\\(CYP\\)。CYP是一類血紅素結合蛋白，可修飾各種天然化合物，包括多酮類化合物、脂肪酸類固醇和一些芳香族化合物。
環孢菌素具有高效免疫抑制作用，抗HIV-1病毒和逆轉腫瘤多藥耐藥性等作用。但是，環孢菌素的肝腎毒性以及生物利用度低等缺點影響了它在這些領域的開發利用。因此，對環孢菌素的免疫抑制作用機制等生物活性進行研究，并在此基礎上尋找作用特異、毒副作用低、生物利用度高、活性更強的低毒高效衍生物已成為世界范圍內研究開發環孢菌素的一個熱點。有研究表明稀有放線菌Nonomuraea dietziae具有重要的工業意義，它編碼表達的CYP蛋白區域選擇性羥基化環孢菌素A，得到四羥基環孢菌素衍生物[γ-HyMeLeu4]CyA，為了更好的開展[γ-HyMeLeu4]CyA工業化生產，提高收益，降低生產成本，本研究對該菌株發酵配方和培養條件進行優化，最終使[γ-HyMeLeu4]CyA搖瓶效價提高了63%左右。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
稀有放線菌Nonomuraea dietziae ZL-10-3由本實驗室保存。
1.1.2 培養基
\\(1\\)分離及斜面培養基\\(%\\) 酵母粉0.4，麥芽粉1.0，葡萄糖0.4，瓊脂2.0，pH7.0。
\\(2\\)種子培養基\\(%\\) 淀粉1.0，葡萄糖0.7，麥芽粉0.5，酵母粉0.5，蛋白胨0.5，碳酸鈣0.7，pH7.0。
\\(3\\)發酵培養基同種子培養基。
1.2 方法
1.2.1 斜面培養
用竹簽挑選單個菌落轉接于斜面培養基，28℃下培養15d。
1.2.2 搖瓶培養
斜面上的孢子接種于種子培養基中，28℃，220r/min培養44~48h，然后以10%的接種量接種于發酵培養基中，28℃，220r/min搖床培養，24h后向發酵培養基中添加底物環孢菌素A，添加量為300μg/mL，添加底物后的培養時間為120h。
1.2.3 發酵條件優化
在40mL的三角瓶發酵體系\\(總容積250mL\\)中，按1.2.2的發酵條件，分別對底物添加時間，添加量和添加底物后的培養時間進行優化研究。
1.2.4 樣品檢測
4mL發酵液倒入刻度離心管中，加入1mL無水乙醇，3000r/min離心10min后取上清液，HPLC 法測發酵效價\\(μg/mL\\)。
2結果和分析
2.1 配方優化
本實驗室初始的發酵培養基和種子培養基共用一種配方，為了提高目標產物收益，依照生產上的經驗，我們對糊精、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和黃豆餅粉這5個因素的配比進行了考察。設糊精、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和黃豆餅粉五個因素分別為自變量X1、X2、X3、X4和X5，相對發酵效價為因變量Y1，各因素及水平列表1。根據均勻設計V4.0 版軟件提供的模型，設計實驗。
由該模型得到的最優發酵培養基組成為：糊精1.2%、葡萄糖3.0%、酵母粉0.9%、蛋白胨0.5%、黃豆餅粉1.5%，預測最優結果為147.4μg/mL。經3批驗證實驗，相對效價依次為135.1%，140.6%和136.8%，平均效價為137.5%，結果表明該配方所得發酵效價相比對照平均提高約37.5%，優于設計實驗中各組配方。
2.2 培養條件優化
2.2.1 底物添加時間對發酵單位的影響
底物添加時間對發酵單位的影響非常大，過早菌體生長不成熟，過晚菌體老化，酶活降低。我們分別選取0、12、24、36和48h共計5個時間點向發酵培養基中添加底物環孢菌素A。由圖1可知，48h時該菌發酵單位較36h時的高，但是幅度不大，為了縮短發酵周期，減少生產成本，我們選擇36h為最適的底物添加時間?！緢D1】
2.2.2 底物添加量對發酵單位的影響
因為底物環孢菌素A是溶解在有機溶劑甲醇中，甲醇和環孢菌素A本身對菌體有影響，濃度過高會抑制菌體生長，從而造成轉化收益降低。按照1.2.2搖瓶發酵培養條件，分別選取200、300、400、500和600μg/mL這5種底物濃度，考察何種濃度是添加底物的最適濃度。根據圖2顯示，終濃度為400μg/mL即1mL發酵培養基中含400μg的環孢菌素A底物時，衍生物有最大的收益?！緢D2】
2.2.3 培養時間對發酵單位的影響
按照1.2.2搖瓶發酵培養條件，分別選取添加底物添加后的24、48、72、96、120和144h共計6個時間點放瓶。由圖3可知，添加底物96h后發酵單位達到最高，之后無明顯變化。于是我們選擇96h為最適放瓶時間?！緢D3】
2.3 驗證試驗
本研究在優化后的發酵培養基和培養條件下對菌株ZL-10-3進行試驗驗證，結果表明，[γ-HyMeLeu4]CyA的產量從174.2μg/mL提高到了284.3μg/mL，較優化前提高了63%左右。
3 結論
本研究利用稀有放線菌Nonomuraea dietziae編碼表達的CYP蛋白酶一步合成 [γ-HyMeLeu4]CyA[13]，較之化學合成，生物體內轉化合成產物單一，便于生產上的分離提取，對環境污染小更加適應目前環境保護的要求。
關于稀有放線菌Nonomuraea dietziae更多的是在基因功能的報道，本研究首次從工業方面著手，采用均勻設計法對[γ-HyMeLeu4]CyA轉化菌Nonomuraea dietziae的發酵培養基配方進行優化，并對其培養條件進行摸索，最終獲得了最佳的發酵培養基和最合適的培養條件。后續研究可在菌種選育方面進一步優化，以便適應工業化的大規模生產。
