六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸，由于處方中含有動物藥\\( 人工牛黃、麝香、珍珠母、蟾酥\\) 、植物藥\\( 熟地黃、酒萸肉、乳香、沒藥、山藥、牡丹皮、大黃、茯苓、澤瀉、青黛、天花粉\\) 和礦物藥\\( 雄黃\\) ，且制法為以部分生藥粉入藥，所以均屬于含藥材原粉的中成藥口服給藥制劑。相對于化學藥品，雖然中成藥通過炮制、加工、提取等手段處理后其微生物種類和數量都有一定程度的下降，但仍具有微生物客觀存在的事實，國外藥典均收載了中藥材\\( 飲片\\) 的微生物限度檢查方法和標準，而中國藥典尚未收載相關內容。據此，本文按照 2010 年版中國藥典和 16 版日本藥局方的微生物限度檢查方法，對上述 3 種中成藥及其主要原料藥\\( 珍珠母、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、沒藥\\) 進行微生物限度檢查，并將從樣品中檢出污染微生物進行菌株鑒定分析，探討中成藥口服給藥制劑與其原料藥檢出污染微生物之間的相關性，為中成藥和中藥材\\( 飲片\\) 的微生物限度標準合理化和產品質量提高，提供參考依據。
1 儀器與材料
生物安全柜\\( 美國 Thermo 公司\\) ，生化培養箱\\( 德國 Binder 公司\\) ，Phoenix 100 型全自動細菌鑒定試驗系統\\( 美國 BD 公司\\) ，Crystal Spec 型比濁儀\\( 美國 BD 公司\\) 。
六味地黃丸: 144 批\\( 30、36、54、60、72 g·瓶－ 1，6 g·袋－ 1，9 g·丸－ 1\\) ，北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠、廣州白云山和記黃埔中藥有限公司、貴州百靈企業集團制藥有限公司、哈藥集團世一堂制藥廠等 54 個藥廠。
牛黃消炎片: 114 批\\( 0. 05g·片－ 1\\) ，長春海外制藥集團有限公司、大連輝仁制藥有限公司、多多藥業有限公司、撫順澎健藥業有限公司、哈爾濱華雨制藥集團有限公司、哈藥集團世一堂制藥廠、河北永豐藥業有限公司、黑龍江葵花藥業股份有限公司、吉林省輝南天宇藥業股份有限公司、金昌金丹藥業有限公司、山東仙河藥業有限公司、上?；氏箬F力藍天制藥有限公司、煙臺天正藥業有限公司、藥都制藥集團股份有限公司。
西黃丸: 67 批\\( 3g·瓶－ 1\\) ，北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠、本溪仙草堂藥業有限公司、吉林濟邦藥業有限公司、濟南宏濟堂制藥有限責任公司、九寨溝天然藥業集團有限責任公司、遼寧華鑫藥業有限公司、遼寧仙鶴制藥有限責任公司、四川康定金珠制藥有限責任公司、天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥廠、通化金馬藥業集團股份有限公司、通化玉圣藥業股份有限公司、武漢健民大鵬藥業有限公司、浙江天一堂藥業有限公司。
原料藥: 珍珠母\\( 205042\\) 、熟地黃\\( 204211\\) 、酒山茱 萸 \\( 301161 \\) 、牡 丹 皮 \\( 303091 \\) 、醋 沒 藥\\( 208071\\) ，\\( 500 g·袋－ 1\\) ，北京華邈中藥工程技術開發公司。
培養基: 膽鹽乳糖增菌液、玫瑰紅鈉瓊脂、營養瓊脂、營養肉湯、改良馬丁、改良馬丁瓊脂、胰酪胨大豆瓊脂培養基 \\( 批號分別為 1009162、1007052、1103092、100628、090903、090925、120730，北京三藥科技開發有限公司，靈敏度實驗符合 2010 年版中國藥典規定\\) 。
枯草 芽 孢 桿 菌 \\( Bacillus subtilis\\) ［CMCC －B63501］、金黃色葡萄球菌 \\( Staphylococcus aureus\\)［CMCC － B 26003］、大腸埃希菌\\( Escherichia coli\\)［CMCC － B 44102］、白色念珠菌\\( Candida albicans\\)［CMCC － F 98001］，中國醫學細菌保藏中心; 黑曲霉\\( Aspergillus niger\\) ［CMCC － F 98003］，中國食品藥品檢定研究院。
試劑: 鑒定培養液、革蘭氏陽性細菌鑒定/藥敏板、革蘭氏陰性細菌鑒定/藥敏板 \\( 批號分別為2107002、2046476、2088399，碧迪醫療器械上海有限公司\\)
2 方法
參照 2010 年版中國藥典一部微生物限度檢查法進行實驗，簡述如下。
2. 1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，30 ～ 35 ℃ 培養 18 ～ 24 h; 接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，23 ～28 ℃ 培養 24 ～ 48 h。上述培養物用 0. 9% 的無菌氯化鈉溶液制成每1 mL 含菌數為50 ～100 cfu 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中，23 ～28 ℃培養5 ～7 d，加入0. 9%的無菌氯化鈉溶液 3 ～5 mL，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無菌試管內，用 0. 9%的無菌氯化鈉溶液制成每 1 mL含孢子數為 50 ～100 cfu 的孢子懸液。
2. 2 供試液制備 稱樣品 10 g，加 pH 7. 0 無菌氯化鈉 － 蛋白胨緩沖液至 100 mL，用勻漿儀混勻或搖勻，得 1∶ 10 供試液，備用。
2. 3 細菌、霉菌和酵母菌計數檢查驗證試驗 培養基稀釋法: 取不同量的供試液\\( 1∶ 10\\) 入皿，加入驗證菌，然后每皿加營養瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養基約 20 mL，搖勻，即培養基稀釋。如 1 mL·皿－ 1為1∶ 200 稀釋，0. 5 mL·皿－ 1為 1∶ 400 稀釋。細菌置35 ℃ 培養; 霉菌和酵母菌置 25 ℃ 培養，觀察結果。
2. 4 細菌、霉菌和酵母菌計數檢查試驗 培養基稀釋法: 為保證樣品中污染微生物計數的準確性，取不同量的供試液\\( 1∶ 10\\) 、\\( 1∶ 100\\) 入皿，然后每皿加營養瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養基約 20 mL，搖勻。細菌置35 ℃培養; 霉菌和酵母菌置25 ℃培養，觀察結果。
2. 5 污染菌株分析 使用無菌棉簽挑取從六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸及其原料藥中分離的污染菌落至鑒定培養液中，混勻，使用比濁儀調節菌液濃度在0. 5 ～0. 6 McF 范圍內。將菌液倒入藥敏板，將藥敏板放入全自動細菌鑒定試驗系統進行菌株分析。
3 結果與討論
3. 1 微生物限度檢查法的建立 采用培養基稀釋法檢查六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸時，樣品經1: 200 稀釋后對篩選菌株枯草芽孢桿菌的平均回收率為 92%、89%、90%，在此條件下，用其余 4 株驗證菌株進一步驗證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉以及白色念珠菌的平均回收率，結果見表 1。
采用上述方法檢查珍珠母、熟地黃、酒山茱萸、牡丹皮、醋沒藥時，樣品對篩選菌株枯草芽孢桿菌的平均回收率為 96%、94%、89%、90%、96%、，在此條件下，用其余 4 株驗證菌株進一步驗證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉以及白色念珠菌的平均回收率，結果見表 2?！颈?-2】
3. 2 六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸及其原料藥的微生物限度檢查結果 六味地黃丸的細菌數檢查結果，＜10 cfu·g－ 1為39 批; 10 ～100 cfu·g－ 1為63批; 100 ～500 cfu·g－ 1為 22 批; 500 ～1000 cfu·g－ 1為 11 批; 1000 ～5000 cfu·g－ 1為 6 批; 5000 ～10000cfu·g－ 1為 3 批。霉菌和酵母菌數檢測結果，均為＜ 10 cfu·g－ 1。
牛黃消炎片的細菌數檢查結果，＜10 cfu·g－ 1的有24 批;10 ～100 cfu·g－ 1的有19 批;100 ～500 cfu·g－ 1的有21 批; 500 ～1000 cfu·g－ 1的有 6 批; 1000 ～5000 cfu·g－ 1的有 28 批; 5000 ～10000 cfu·g－ 1的有16 批。霉菌和酵母菌數檢測結果，均 ＜ 10 cfu·g－ 1。
西黃丸的細菌數檢查結果，＜ 10 cfu·g－ 1的有45 批; 10 ～ 100 cfu·g－ 1的有 5 批; 100 ～ 500 cfu·g－ 1的有 6 批; 500 ～1000 cfu·g－ 1的有 2 批; 1000 ～5000 cfu·g－ 1的有 5 批; 5000 ～10000 cfu·g－ 1的有4 批。霉菌和酵母菌數檢測結果，均 ＜ 10 cfu·g－ 1。
所有批次的檢品中，六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸的細菌數檢測結果，＜10 cfu·g－1的有108 批;10 ～1000 cfu·g－1的有154 批;1000 ～10000 cfu·g－ 1的有 62批; 霉菌和酵母菌數檢測結果，均為 ＜10 cfu·g－ 1。
其主要原料藥的 3 次細菌數檢查平均結果分別為: 珍珠母 7800 cfu·g－ 1; 熟地黃 670 cfu·g－ 1; 酒山茱萸 290 cfu·g－ 1; 牡丹皮 3600 cfu·g－ 1; 醋沒藥6700 cfu·g－ 1。3 次霉菌和酵母菌數檢測結果均為＜ 10 cfu·g－ 1。
3. 3 污染菌株鑒定結果 對從六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸中檢出的污染菌進行菌株分析。檢出枯草芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、簡單芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、莫海威芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、彎曲芽孢桿菌、短芽孢桿菌、斯潤金芽胞桿菌、陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌、少動鞘氨醇桿菌、糖原甲基菌、成團泛菌、非脫羧勒克氏菌、弗氏志賀氏菌、溶黃嘌呤厄氏菌、傷口埃希氏菌、莫拉氏菌、金氏金氏菌、路鄧葡萄球菌、人葡萄球菌、克氏葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯菌臭鼻亞種、假單胞菌某些種、科氏葡萄球菌科氏亞種、西地西菌 EO －2 群，共計 31 株污染菌。
從珍珠母、熟地黃、酒山茱萸、牡丹皮、醋沒藥中檢出金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、克氏葡萄球菌、緩慢葡萄球菌、環狀芽孢桿菌、雞葡萄球菌、矮小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、松鼠葡萄球菌、凝固芽孢桿菌、短芽孢桿菌，共計 13 株污染菌。
近年來隨著大量抗生素和免疫抑制劑的廣泛應用，許多傳統上不致病或無毒性的微生物越來越多地成為人體感染的主力軍。例如: 金黃色葡萄球菌、假單胞菌、芽孢桿菌、微小桿菌等均會在人體基礎病變引起機體防衛功能降低時導致各種機會感染。所以，雖然上述污染菌株多為環境常見菌，沒有危害性較大的致病菌，但也屬于條件致病菌，其用藥對象若是嬰幼兒及衰弱患者，就會導致使用該藥品的患者受到感染。
4 討論
藥品衛生標準是保證藥品質量的重要因素，從上述菌株鑒定結果可知，六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸與其主要原料藥中檢出的污染微生物均有重復出現，其中絕大部分為芽孢桿菌，因此從上述 3 種中成藥中分離得到的污染菌，很可能來自其生產所用的原料\\( 中藥材和飲品\\) 。中藥材和飲品因含有大量的有機質，在生長、儲藏、加工過程中易受各種微生物的污染，尤其極易受到芽孢桿菌屬的污染，直接影響制劑成品的質量，例如: 芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌主要來源于土壤。而且，中成藥口服給藥制劑多源于天然植物、動物和礦物，其生產工藝特殊，雖然通過炮制、加工、提取等手段處理后其微生物種類和數量都有一定程度的下降，但相對于化學藥品，仍具有微生物客觀存在的事實。所以，如果不重視中成藥口服給藥制劑生產過程的微生物控制，就會增加誘發其微生物污染因素，部分污染菌在產品的滅菌、烘干等加工過程中還會形成可以抵抗物理和化學屏障的生物膜，甚至變異為傳統生理生化方法無法檢出的條件致病菌。因此要意識到成品控制滿足不了產品污染微生物的控制，需要結合更多生產過程控制保證產品質量，例如: 將污染菌株的分離、鑒定與分析作為中成藥口服給藥制劑及其原料藥質量標準的重要組成部分，進一步開展生產過程與微生物限度檢查結果相關性的研究，以減少中成藥生產各工序環節中誘發藥品微生物污染因素。
此外，中成藥生產企業應徹底改變傳統的生產面貌，例如，采用標準廠房、標準取樣室和標準凈化實驗室，生產上形成機械化、管道化、連續化的制劑和包裝工序的生產線，將所用藥材按規定進行揀選、整理、洗滌等前處理加工，生產過程控制在不同潔凈級別的廠房內，就能把微生物的含量控制在一定范圍內，并輔以適宜的滅菌方法，就能保證藥品的衛生質量，例如: 含原生藥粉的丸劑，國家規定的微生物限度為不超過 30000cfu·g－ 1，若前處理后微生物含量為 200000 cfu·g－ 1，用6 kGy 輻照的輻照劑量，把微生物降低 89% ～97% \\( 即為 6000 ～ 22000 cfu·g－ 1\\) ，就能符合微生物控制標準。同時，還可將計算機用于生產過程控制和管理，采用先進的檢測儀器，例如: 利用水活度檢測技術，控制中成藥微生物生長和產品質量的關鍵控制指標。并建議適當改變國家藥典的中成藥口服制劑質控標準，例如，參考國外中成藥質控標準，增加中成藥的控制菌檢查種類。
這樣，將才有助于中藥的健康發展，最終使我國中成藥生產企業能夠參與國際藥品貿易競爭和中藥產品的國際貿易簽證體制。
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