哺乳動物雄性生殖系統各器官的炎癥均可以引起機體生殖功能障礙，主要病理表現為抑制睪丸產生雄性激素、精子數目減少、活力降低、暫時性喪失生育能力及疼痛等[1].Toll樣受體（Toll-like re-ceptors,TLRs）是存在于機體內的一類重要的模式識別受體（pattern recognition receptors,PRRs），通過識別多種病原相關分子模式（pathogen associatedmolecular patterns,PAMPs），例如脂多糖（lipopo-lysaccharide,LPS）、肽聚糖（peptidoglycan,PGN）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid,LTA）等介導機體的天然免疫應答；該受體還能進一步通過信號傳導啟動獲得性免疫應答，為天然免疫和獲得性免疫之間架起了一座橋梁，從而促使機體免疫系統在抵抗病原體方面發揮重要作用。目前發現，TLRs家族至少有13個 成 員，牛 的 組 織 中TLRs包 括TLR1~TLR10[2-5].TLRs主要表達于免疫系統的單核細胞系，同時也表達于其他組織的成纖維細胞、上皮細胞等。最新研究證實，在人、大鼠、小鼠、豬和家兔等動物的生殖組織及細胞中均發現不同TLRs的表達[6],推測TLRs在保護生殖系統免受病原體感染和降低炎癥對生殖系統的損害方面發揮了重要作用。
牦牛（Bos grunniens）是青藏高原居民飼養的最重要的牲畜，也是藏族牧民重要的經濟來源。然而，高原型牦牛繁育率僅為27.76%~37.87%（平均為32.07%）[7],其原因除了營養的供應不均衡之外，是否與牦牛生殖系統抗感染能力相關，還需深入的研究。為了解TLRs在牦牛生殖系統的表達情況并豐富牦牛生殖系統中先天性免疫功能基因的研究資料，本研究應用RT-PCR技術從牦牛脾組織中克隆TLR1~TLR10基因，并以雄性牦牛生殖器官為材料，通過RT-PCR技術檢測雄性牦牛生殖器官（睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾、輸精管和陰莖）中TLR1~TLR10mRNA的表達水平。
1、材料與方法
1.1、試驗樣品
成年健康麥洼牦牛，產于四川省阿壩州，由四川省雅安市多營清真屠宰場提供。屠宰后分別采集牦牛的脾、睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾、輸精管和陰莖，分裝于含RNA樣品保存液的離心管中，4℃過夜，-80℃保存。
1.2、主要試劑及儀器
RNA樣 品 保存 液、RNA Simple Total RNAKit、質粒小提試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker、Greenview均購自天根生化科技（北京）有限公司pMD19-T Simple載體購自寶生物工程 （大 連）有 限 公 司。RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit由Fermentas公 司 購 買。EZNATMGel Extraction Kit購自美國OMEGA公司。其余試劑均為國產或進口分析純。
1.3、引物的設計與合成
根 據 美 國 國 立 生 物 技 術 信 息 中 心 （NationalCenter of Biotechnology Information,NCBI）Gen-Bank中已登錄的牛TLR1（NM_001046504）、TLR2（AF368419）、TLR3（NM_001008664）、TLR4（NM_174198）、TLR5（GQ866979）、TLR6（NM_001001159）、TLR7（DQ333225）、TLR8（EF583902）、TLR9（NM_183081）、TLR10（AY634632）和家牛（Bos taurus）看家基因GAPDH（NM_001034034）的序列，利用軟件Primer 5.0分別設計1對引物（F和R）用于目的基因的特異性擴增（見表1）。這些引物均由北京華大基因有限公司合成。
按照總RNA提取試劑盒說明書提取牦牛脾總RNA,參照RevertAid First Strand cDNA Synthe-sis Kit說明書操作合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA為模板，PCR擴增TLR1~TLR10基因。反應體系如下：cDNA模板1μL,2×Taq PCR MasterMix 10μL,上、下游引物各1μL,補足無RNA酶的ddH2O至20μL.
PCR擴增程序：94℃預變性3min;94℃變性30s,退火30s,72℃延伸45s,30個循環；72℃延伸10min;4℃保存。15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。
1.5、牦牛TLRs基因的克隆及測序
將50μL擴增產物進行凝膠電泳，按DNA回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD19-TSimple Vector載體16℃過夜連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆菌落。經菌液PCR和質粒PCR鑒定的質粒送北京華大生物技術有限公司測序。獲得的序列進行BLAST比對。
1.6、牦牛TLRs基因器官表達譜及半定量分析
分別提取牦牛脾、睪丸、附睪（頭、體和尾）、輸精管和陰 莖 中 總RNA,進 行RT-PCR擴 增 （以 基 因GAPDH為內參基因），每份樣本半定量RT-PCR重復3次。
PCR反應程序：94℃預變性4min;94℃變性30s,退火30s,72℃延伸45s,共30個循環；72℃延伸10min.
15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并拍照。電泳圖片經Quantity One軟件計算各條帶灰度值，并按公式計算出TLR1~TLR10mRNA在各組織的相對含量（目的基因mRNA相對含量=目的基因條帶灰度 值÷相應 內 參 基 因 條 帶 灰 度 值×100%），并對結果進行統計學分析。
2、結果
2.1、牦牛TLRs基因的RT-PCR擴增
瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，RT-PCR分別擴增出TLR1~TLR10基因的預期條帶（見圖1）。
2.2、菌液和質粒的PCR鑒定
PCR擴增產物的電泳結果顯示，菌液和質粒電泳條帶處出現與預期相吻合的目的條帶（見圖2），證實TLRs基 因 序 列 已 被 成 功 插 入 克 隆 載 體。
BLAST比對結果顯示，克隆的牦牛TLRs基因序列與NCBI中已登錄的家牛TLRs基因編碼區核苷酸序列的相似性均在98%~100%之間，說明克隆的基因序列為牦牛TLRs基因。
2.3、牦牛TLRs基因器官表達譜及半定量分析
瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，TLR1~TLR10mRNAs在牦牛睪丸、附睪（頭、體和尾）、輸精管和陰莖中均有不同程度的表達。半定量分析結果（見圖3）顯示，TLR1mRNA和TLR3~TLR9mRNAs在睪丸、附睪、輸精管和陰莖中均相對高表達，各器官之間差異不顯著；TLR2mRNAs在附睪尾和輸精管中相對低表達，在其他組織中相對高表達；TLR10mRNA在睪丸、附睪頭、附睪體和陰莖中相對低表達，而在附睪尾和輸精管中不表達。
雄性哺乳動物生殖系統易受細菌、病毒和真菌等病原體感染從而影響生育力，如附睪受大腸桿菌和衣原體感染引起附睪炎和輸精管阻塞，通過影響精子運動而降低了雄性哺乳動物的生育力[8];同時細菌產物如LPS,能夠誘發睪丸炎癥，從而抑制睪丸間質細胞產生雄性激素和生精上皮細胞產生精子。
TLRs是PRRs家族的重要成員，屬于胞外模式識別受體，在先天性免疫中發揮重要作用。TLRs不僅在免疫細胞（巨噬細胞和樹突狀細胞等）中表達，而且雌性哺乳動物的生殖器官存在多種TLRs的表達[9],這說明TLRs對雌性哺乳動物的生殖系統先天性免疫可能非常重要。但是，TLRs在雄性牦牛生殖系統中是否表達及表達豐度還鮮見報道。
TLRs能在人和多種雄性動物生殖器官或細胞中表 達。Naito[10]僅證明了人睪丸表達TLR1~TLR10,而其他生殖器官如附睪、輸精管和副性腺等是否表達TLRs未曾報道。Palladino等[11]首次綜合分析了TLRs及其配體蛋白在雄性大鼠生殖系統中的表達水平，發現TLR1~TLR9在睪丸、附睪和輸精管中高豐度表達，TLR10低表達，TLR11微弱表達。Bhushan等[12]發現，大鼠生精細胞在特定發育時期表達TLR2、TLR3和TLR4,管周細胞高表達TLR3和TLR11,而TLR2、TLR4和TLR6低表達。劉秀芝等[13]研究發現，健康大鼠Sertoli細胞高表達TLR2~TLR8,低表達TLR9和TLR10,未檢出TLR1和TLR5表達；體外感染組與對照組比對發現，TLR2和TLR6表達上調，表明TLRs被激活，參與支持細胞的免疫調節。Wu等[14]研究證明，在小鼠睪丸支持細胞TLR2~TLR5高表達，TLR6、TLR7和TLR13相對低表達。此外，兔睪丸中檢測到TLR2和TLR4的表達[15],豬睪丸中檢測到TLR4的表達[16].當生殖系統受病原入侵時，TLRs識別 相關PAMPs,通過胞漿功能區向細胞內傳遞活化信號，從而激活轉錄因子，誘導促炎性因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等的產生及表達水平上調，啟動機體先天性免疫反應，清除病原體。到目前為止，有少數研究已證明，TLRs相關配體及蛋白在雄性哺乳動物生殖器官中表達。Malm等[17]在人附睪上皮細胞和精子中發現LBP蛋白的表達，該蛋白能夠與革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分LPS相結合形成復合物，再與CD14相互作用，激活TLR4信號途徑，引起機體防御性反應。Riccioli等[18]通過受體激動劑激活TLR2、3和5,使ICAM-1和MCP-1在睪丸支持細胞中表達水平上調。Palladino等[11]發現，TLR接頭蛋白MyD88和TICAM1以及RELA和NFKBIA蛋白在睪丸、附睪和輸精管中高豐度表達。Winnall等[19]證明，TLR4共體蛋白MD2和CD14在大鼠支持細胞中表達。Zhang等[20]發現LPS刺激公雞睪丸和附睪，激活TLR4,從而引起IL-1β、IL-6和CXCLi2表達上調。因此，在雄性哺乳動物的生殖系統中TLRs識別PAMPs后，通過相關信號傳導，刺激TLRs關鍵配體蛋白、促炎性因子及趨化因子等在睪丸、附睪和輸精管中的表達水平上調。
本研究應用RT-PCR技術，從牦牛脾中成功克隆了TLRs基因，并對雄性牦牛生殖器官中TLRs基因mRNA表 達 水 平 進 行 了 檢 測。結 果 顯 示，TLR1、TLR3~TLR9在睪丸、附睪、輸精管和陰莖中相對高表達，TLR2在附睪尾和輸精管中相對低表達；TLR10在睪丸、附睪頭、附睪體和陰莖中相對低表達，在附睪尾和輸精管中不表達。結果表明，TLR1~TLR10在牦牛雄性生殖器官中廣泛表達，推測可能與其參與生殖器官天然免疫以及誘導獲得性免疫密切相關，在抵御牦牛生殖系統感染過程中可能發揮重要作用。
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