遷移侵襲抑制蛋白（ MIIP） 是近些年被發現的新的候選腫瘤轉移侵襲抑制基因，在染色體上定位于 1p36. 22,該區域在包括乳腺癌、胰腺癌、神經膠質瘤和 神 經 母 細 胞 瘤 等 多 種 腫 瘤 中 常 出 現 缺失.自 2003 年 MIIP 被 Song 等研究者發現能夠抑制多形性膠質母細胞瘤侵襲和轉移能力以來，陸續有研究報道了其作用的可能分子機制，包括與胰島素生長因子結合蛋白（ IGFBP） - 2 結合，中和其促進腫瘤轉移的作用; 降低 HDAC6 的穩定性及活性，從而影響組蛋白去乙?；?6（ HDAC6） 對微管系統的乙?；{節，抑制神經膠質瘤細胞的遷移能力等。此外，研究還發現 MIIP 基因的突變轉錄本不能夠抑制腫瘤的侵襲能力,從而進一步證實了 MIIP 的抑癌作用。目前，MIIP 抗腫瘤侵襲轉移作用的詳細機制還不明確。2010 年，一項病例對照研究的結果表明，MIIP 基因的 rs2295283SNP 位點（ codon 167,A > G,K > E） 與乳腺癌的發病風險具有相關性，AG + GG 基因型是乳腺癌的保護因素； 對瘤塊體積 > 2 cm 及中晚期的乳腺癌患者，GG 基因型能夠降低其易感性； 而且，具有 MIIP- G 型等位基因的乳腺癌細胞，其克隆形成能力降低.對 MIIP 蛋白的氨基酸序列分析發現，在 MI-IP 蛋白的第 81 ~ 89、143 ~ 151、173 ~ 181 及 314 ~322 位氨基酸的位置，包含四個可能與 CDC20 （ celldivision cycle 20 ） 識別結合的破壞框 （ Destructionbox,D box） 結構域; 當 MIIP 與細胞周期調節蛋白 CDC20 直接結合后，能夠調節有絲分裂后期促進復合物 APC/C 的活性，抑制細胞周期調節素 Cy-clin B1 的降解來阻止有絲分裂的進行.MIIPrs2295283 SNP 位點恰好臨近 MIIP 的第 3 個破壞框結構域，因而推測該位置單個核苷酸的改變是否會影響 MIIP 與 CDC20 的結合能力而調節細胞的增殖能力。為此，本研究構建了 167 位氨基酸發生K > E 突變的 MIIP 原核表達載體，為后續研究 MIIP的抗腫瘤機制奠定工作基礎。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和質粒： 大腸桿菌 DH5α 感受態和 BL21感受態為本實驗室制備； GEX -4T -1 - MIIP 重組質粒為本實驗室構建。
1. 1. 2 主要試劑： Pfu 高保真 DNA 聚合酶為 NEB公司產品； Peasy - T1 載體購自北京全式金生物公司； 質粒小量提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自北京天根公司； 限制性內切酶 Xho I 和 EcoR I 及 T4DNA 連接酶為 PROMEGA 公司產品； 異丙基硫代 -β - D 半乳糖苷（ isopropyl - β - D - thiogalactoside,IPTG） 、溶菌酶和 PMSF 購自 Amresco 公司； Glutathi-one Agarose 為 Invitrogen 公司產品； 1kbDNA 分子量標準、蛋白分子量標準購自天根公司； DNA 分子量標準（ DL15000） 購自 TaKaRa 公司。
1. 1. 3 引物的設計與合成： 根據 MIIP 基因序列（ GenBank A ccession N umber: NM_021933. 2） 及167位氨基酸所在的編碼序列位置，在其前端和后端分別設計兩對引物，同時分別在前端的上游引物和后端的下游引物的 5‘端分別引入 Xho I 和 EcoRI 的酶切位點。所用引物為，上游 -1: 5'- CGGAATTCAG-GATGGTGGAG GCTGAGGAAC - 3',下游 - 1: 5'-GCCAGCTCCTCTCAGGAACTGCAG - 3 '; 上游 - 2:5'- TCTGCAGTTCCTGAGAGGAGCTGGC - 3',下游- 2: 5 '- CCGCTCGAGT CAGGGCTTCTGCCGTGG-GAC - 3'.引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1. 2 實驗方法
1. 2. 1 pGEX - 4T - 1 - MIIP（ K167E） 原核表達載體的構建： 以 pGEX - 4T - 1 - MIIP 質粒為模板，分別以第 167 位氨基酸（ aa） 前端和后端序列的兩對引物擴增出 MIIP 167aa 的前后兩端序列； 然后以混合的前后兩端序列，不加引物先擴增 5 個循環后，在體系中加入上游 -1 引物和下游 -2 引物，繼續擴增 30個循環獲得 MIIP（ K167E） 突變體的 cDNA 序列。
PCR 擴增條件： 98 ℃ 預變性 30 s,然后 98 ℃ 10 s,60℃ 30 s,72 ℃ 40 s,30 ~ 35 個循環后，最后于 72 ℃延伸 10 min.擴增產物加 poly - A 尾后，與 pEASY- T1 克隆載體于 25 ℃ 下連接 20 min,轉化入 E. coliDH5α 感 受 態 細 胞，獲 得 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 重組質粒； 將其用 Xho I 和 EcoRI 雙酶切進行鑒定，鑒定正確的 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 和pGEX - 4T - 1 空質粒分別再用 Xho I 和 EcoRI 酶切，產物回收后進行連接轉化及酶切鑒定，鑒定正確的 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E） 重組質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序驗證。
1. 2. 2 GST - MIIP （ K167E） 融合蛋白的表達的純化： 將 pGEX -4T - 1 - MIIP（ K167E） 重組質粒轉化入 E. coli BL21 感受態細胞后，挑取單克隆菌落于 3mL 的 LB 培養液（ 含 50 μg·mL- 1的氨芐青霉素） 中37 ℃ 震蕩培養過夜。次日按 1∶ 100 稀釋菌液至適量LB 培養液中（ 含 50 μg·mL- 1的氨芐青霉素） ,37 ℃擴增培養至 OD600 nm約為 0. 8 時，加入終濃度為 0. 2mM 的 IPTG 在 25 ℃ 誘導表達 4 h 后，12 000 ·min- 1,4 ℃ 離心，棄上清； 菌體沉淀用細菌裂解液（ 含 1 mg·mL- 1溶菌酶，1mM PMSF,1% TritonX -100,1. 5% 十二烷基肌氨酸鈉） 冰上裂解 30 min 后，間歇超聲至菌液清亮； 離心收集上清，加入 Glutathi-one 瓊脂糖珠，4 ℃ 過夜結合。次日，離心吸去上清，Glutathione 瓊脂糖珠經 PBS 洗滌后，用還原性谷胱甘肽洗脫液洗脫獲得純化的 GST - MIIP（ K167E） 融合蛋白。
2 結果
2. 1 pGEX - 4T - 1 - MIIP（ K167E） 原核表達載體的構建和鑒定
2. 1. 1 擴增獲得 MIIP（ K167E） 突變體 cDNA 全長序列： MIIP 蛋白共有 388 個氨基酸組成，cDNA 全長約為1 164 bp,故第167 位氨基酸前端的堿基序列為501 bp,后端堿基序列約為 663 bp,全長 cDNA 加上引物兩端引入的酶切位點共約 1 180 bp.以pGEX -4T - 1 - MIIP 重組質粒為模板，經第一次 PCR 反應后，分別擴增出了第 167 位氨基酸前端和后端序列 ; 隨后以前后兩端序列混合后為模板，擴增出 MIIP（ K167E） 突變體的cDNA 全長序列.
2. 1. 2 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 重組質粒的構建和鑒定： 將 PCR 擴增獲得 MIIP（ K167E） 突變體的全長 cDNA 與 pEASY - T1 克隆載體進行連接后，獲得 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 重組質粒。將其轉化至大腸桿菌感受態細胞 DH5α，篩選陽性克隆用 XhoI 和 EcoRI 進行雙酶切鑒定。pEASY - T1 載體大小約為 4 900 bp,MIIP（ K167E） 全長 cDNA 約為 1 180bp,構建成功的重組質粒經酶切后可釋放出大小約4 900 bp 和 1 180 bp 的 2 個片段，圖中泳道 4 和 5 為酶切鑒定正確的質粒。
2. 1. 3 pGEX - 4T - 1 - MIIP（ K167E） 原核表達載體的構建和鑒定： 將 pGEX -4T -1 質粒及酶切鑒定正確的 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 載體分別用 XhoI 和 EcoR I 雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳； 回收酶切后的 MIIP（ K167E） 片段和 pGEX -4T -1 載體，將兩者連接轉化后獲得 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E）重組質粒，挑取 4 個陽性克隆用 Xho I 和 EcoR I 進行雙酶切鑒定 .
pGEX - 4T - 1 載體約為 5 400 bp,泳道 2、3 和 4 的重組質粒經酶切后，均可釋放出5 400 bp 和1 180 bp大小的 2 個片段。從中選取 2 個重組體進行測序，結果與 GenBank 中公布的 MIIP cDNA 編碼序列比對后，證實所選陽性質粒編碼第 167 位氨基酸的密碼子（ AAG） 的第 1 位堿基均發生了 A 到 G 的突變，提示 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E） 突變體重組質粒構建成功。
2. 2 pGEX - 4T - 1 - MIIP（ K167E） 原核表達載體的誘導表達及純化： 以0. 2 mM IPTG 對 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E） 原核表達載體在 25 ℃ 誘導表達 4h 后，收集誘導的菌體沉淀，用酶法及超聲法進行裂解，離心后收集上清，沉淀用同等體積的 PBS 垂懸后，對誘導獲得的全菌、菌液上清及沉淀行 SDS -PAGE 電泳并染色，以觀察所得 GST - MIIP（ K167E）是否為可溶性表達。結果如圖 3 所示（ 目錄后） ,與未誘導菌液相比，誘導后的全菌在 65 kDa 左右的位置上可見 1 條明顯的特異性蛋白帶（ GST 標簽分子量為26 kD,MIIP（ K167E） 蛋白分子量約為43 kD,故GST - MIIP 融合蛋白分子量約為 69 kD） .全菌經裂解后，在上清及沉淀中均可觀察到 GST - MIIP（ K167E） 融合蛋白條帶，提示 GST - MIIP 融合蛋白部分以可溶性形式進行表達，部分形成了不溶性的包涵體。
隨后，采用 Glutathione 瓊脂糖珠，對存在于上清中可溶性的 GST - MIIP（ K167E） 融合蛋白進行了純化。經純化后，獲得了純度相對較高的 GST - MIIP（ K167E） 融合蛋白。
3 討論
侵襲和轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征，也是臨床上絕大多數腫瘤患者的致死原因。腫瘤的侵襲轉移是多因素、多步驟、多基因相互協調作用的復雜過程。
MIIP 是新近發現的一個潛在的腫瘤轉移抑制基因，在染色體上定位于1p 36.22,基因全長12.6 kb,編碼388 氨基酸組成的蛋白質，蛋白分子量約為 43 kD.
MIIP 蛋白有較強的親水性，具有 3 個 SEG domain 和 1個能與整合素結合的 RGD motif.此外，在其第 81 ~89、143 ~ 151、173 ~ 181 及 314 ~ 322 位氨基酸的位置，包含 4 個破壞框（ Destruction box,D box） 結構域.
D box結構域是一段由 9 個氨基酸組成的特殊的序列（ RXXLXXXXN,X 代表任意氨基酸） ,其中第 1 位的精氨酸（ R） 和第 4 位的亮氨酸（ L） 高度保守。含有D box結構域的蛋白被認為是控制細胞周期進程的后期促進復合體/周期體（ APC/C） 蛋白復合體的底物，可通過與 APC/C 的共激活因子 CDC20 或 Cdh1 結合而募集在 APC/C 復合體的周圍。一般情況下，作為一種泛素連接酶 E3,APC/C 會促進底物蛋白質的泛素化降解。這一過程對細胞周期的正常進行具有重要的調節作用，正是在 APC/C 的作用下，Cyclin B1 發生降解，進而 CDK1 完全失活，才使得有絲分裂從中期進入后期.在多種惡性腫瘤中，均出現了 APC/CCdc /20 或 APC / CCdh1 復合物的功能失調，這種失調，可能引起細胞中抑癌蛋白的過度降解或者癌蛋白在的大量蓄積。Ji 等的研究結果顯示，MIIP 的高表達能夠抑制多種腫瘤細胞（ 如神經膠質瘤細胞、結腸癌細胞、子宮內膜癌細胞及乳腺癌細胞） 的體外增殖能力； 進一步的分子機制研究表明，MIIP 可能是一個有絲分裂檢查點蛋白，是 APC/C 的關鍵調節因子，可通過與 CDC20 結合來調節 APC/C 的活性，進而抑制細胞周期調節素 Cyclin B1 的降解來阻止有絲分裂的進行.
在一項病例對照研究中，研究者發現 MIIPrs2295283 SNP 位點的差異與乳腺癌的發病風險相關.該 SNP 位點從 A > G 的單個堿基的改變，使MIIP 蛋白 NH2 末端第 167 個密碼子編碼的氨基酸由賴氨酸變為谷氨酸。其中，AG + GG 聯合基因型者乳腺癌的發病風險要低于 AA 基因型者。同時，他們還發現，具有 MIIP 167E（ G 變異性） 乳腺癌細胞的體外增殖能力減弱。由于第 167 位氨基酸與上述MIIP 的第 3 個 D box 結構域（ 173 ~ 181） 非常接近，這一位置的氨基酸改變極有可能影響到該 D box 結構域的功能，進而可能會影響 MIIP 與 CDC20 的結合及對 APC/C 的調節作用，因而表現出細胞增殖能力的改變。為此在本研究中，我們構建了 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E） 突變體重組質粒，并對其進行了表達和純化，為進一步探索 MIIP 的分子功能、解釋其分子作用機制提供一個有力的研究工具。
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