花鼠 Tamias sibiricus 屬嚙齒目松鼠科小型半樹棲種，在我國東北、華北、陜西北部以及秦嶺地區廣泛分布（鄒波等，1997） .花鼠通常取食樹木和經濟作物的種子以及各種堅果和漿果，對經濟作物和林木造成嚴重破壞?；ㄊ蟛粌H吃掉作物，而且會貯存大量作物種子，最多可達作物產量的 75% 以上，造成嚴重的經濟損失（祁勐等，2009） .傳統防治花鼠的方法包括籠捕法和毒餌法（周淑榮，2009） ,盡管在一定程度上可以達到控制花鼠數量和保護林木植物的目的，但普遍面臨著工作量大、滅鼠效率低、效果差、專一性差、花鼠種群恢復快等問題。因此，尋求一種安全、高效、持久且專一性強的防治措施便成為了急需解決的問題（Córdoba et al. ,2006） .

不育控制的概念最早由 Knipling（1959） 提出，并在 20 世紀 90 年代初，免疫不育技術已涉及到了控制有害生物領域。不育技術通過控制雄性或雌性個體絕育或干擾胚胎著床發育，以降低生育率來控制種群數量。目前，有關免疫不育技術的研究已經成為不育控制鼠害的重點，免疫不育是指利用基因重組等分子生物學技術制造使有害生物產生不育的疫苗。21 世紀以來，重組病毒性不育疫苗已經接近實用化（張知彬，2000） ,其研究探索的主要方向是依靠攜帶不育疫苗的病毒在害鼠種群中傳播，使不育疫苗在害鼠體內產生免疫反應，破壞生殖系統，導致害鼠不育（劉漢武等，2011） .由于抗原通常是自身蛋白類或核酸物質，具有特異性結合、對環境無污染、對非靶標動物安全等特點（張浩等，2013） .免疫機制一旦形成，終身具有免疫作用，因此目前在免疫不育研究方面的一個重要熱點是，以精子表面抗原制備疫苗，誘導產生精子抗體并產生不育效果（孫美玉等，2009） .

乳酸脫氫酶 C（lactate dehydrogenase,LDH-C） 是一類四聚體寡聚酶，位于糖酵解途徑的末端，能特異性地催化丙酮酸和乳酸之間的氧化還原反應。在哺乳動物中，LDH 存在 3 種類型的同工酶亞基： LDH-A、LDH-B 和 LDH-C.LDH-C 是組織特異的同工酶，哺乳動物中 LDH-C 基因只在成熟的睪丸組織中表達，且在成熟精子細胞里只存在 LDH-C4 一種形式（Burgos et al. ,1995） .已有研究表明，缺失 LDH-C 基因的雄性小鼠生育能力會嚴重降低 （Odet etal. ,2008） ,這也說明了 LDH-C4 是設計節育藥物的一個很好的靶蛋白。事實上，已有試驗以 LDH-C 為抗原制備抗體，并發現可以有效降低哺乳動物的生育能力（Wei et al. ,2001） .

我國的免疫不育疫苗研究還處于探索階段，目前大多以雌性動物卵透明帶為研究對象設計不育藥物，其效果進展有限，對于雄性不育技術，尤其是花鼠的研究更是空白。因此，本試驗針對雄性花鼠進行免疫不育的防治研究，通過克隆花鼠 LDH-C 基因編碼區序列，對其翻譯的氨基酸序列進行初步分析預測，并進行原核表達的初步探究，以期為蛋白研究和針對花鼠的不育鼠藥研究奠定基礎。

1 材料與方法

1. 1 材料

供試動物： 花鼠捕于陜西省西安市周至縣，8 周齡左右。將花鼠飼養在實驗室普通大號鳥籠，置于通風良好的安靜房間，每只 20 cm 左右長度的花鼠每 2 天喂 1 塊蛋糕，每 3 天換 1 次清水，放 1 個蘋果，每周清理 1 次排泄物。

試劑： RNA 提取試劑盒、ES Taq MasterMix、DNAMarker、核酸上樣緩沖液、抗 His 單克隆抗體、羊抗鼠IgG-Biotin 均購自北京康為世紀生物科技有限公司；瓊脂糖購自美國 HyraGene 公司； 反轉錄試劑盒購自立陶宛 Fermentas 公司； PCR 試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司； 高效瓊脂糖 DNA 凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京） 有限公司； pMD19-T 載體、IPTG、X-gal 均購自日本 TaKaRa 公司； 氨芐青霉素購自北京索萊寶科技有限公司； 酵母提取物和蛋白胨購自英國 OXOID 公司； 感受態細胞 DH5α 和蛋白質Marker 購自北京全式金生物科技有限公司； 牛血清蛋白購自瑞士 Roche 公司； Tween -20 購自德國 Sigma-Aldrich 公 司； HRP-Sterptavidin 結 合 物 購 自 美 國ZYMED 公司； 其它試劑均為國產分析純。

儀器： 9700 型 PCR 儀，美國應用生物系統公司； 5424R 高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；Gel Doc XR + 凝膠成像系統，美國 Bio RAD 公司；NANOPAC-300 型電泳儀，英國 Cleaver Scientific 有限公司； DYCZ-24DN 型迷你蛋白雙垂直電泳槽和DYCZ-40D 型轉膜電泳儀，北京六一儀器廠。

1. 2 方法

1. 2. 1 花鼠睪丸總 RNA 提取及第一鏈 cDNA 合成

花鼠解剖后取睪丸組織迅速放入液氮中保存，取約 50 mg 睪丸組織置于研缽中，液氮研磨成粉末狀，按照康為世紀超純 RNA 提取試劑盒步驟操作提取總 RNA.第一條 cDNA 鏈合成按照 Fermentas 反轉錄試劑盒步驟操作進行。

1. 2. 2 LDH-C 基因克隆

根據 GenBank 已經收錄的多紋黃鼠 Spermophi-lus tridecemlineatus LDH-C 基因的 mRNA 序列（XM_005326851. 1） ,針對整個 CDS 區設計特異性引物，并委托生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。

設計的引物序列如下： 上游引物： 5'-ATGTCAACT-GTCAAGGAG-3',下 游 引 物： 5'-TTAAAATTCCA-GATCCTTTTG-3'.以合成的 cDNA 鏈為模板進行PCR 擴增。反應體系為 25 μL,其中模板 1 μL、上下游引物各 1 μL、滅菌水 9. 5 μL、ES Taq MasterMix12. 5 μL.反應條件為： 94 ℃ 預變性 5 min,94 ℃ 30s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,72 ℃ 7 min,循環 35 次，4℃ 結束反應。產物以 1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。PCR 產物經膠回收純化后，連接到 pMD19-T 載體上，隨后轉化到 DH5α 感受態細胞中，取 30 μL 涂布于含氨芐青霉素（ampicillin,Amp） 的 LB（luria-bertani） 固體培養基，37 ℃ 培養 12 h 后，挑取單克隆菌落接種于含 Amp 的 LB 液體培養基中，振蕩過夜培養。菌液 PCR 驗證后，篩選陽性轉化子送生工生物工程（上海） 股份有限公司測序。

1. 2. 3 花鼠 LDH-C 基因序列分析用 DNAMAN 軟件進行氨基酸推測。蛋白質分子量、等電點和氨基酸組成的分析用 Expasy Protpar-ma在線工具。蛋白質跨膜區的預測、信號肽和二級結構的預測采用 CBS Prediction Servers （www. cbs. dtu. dk/serv-ices / ） 進行分析。

1. 2. 4 原核表達載體的構建與鑒定

根據測序得到的序列分析含有的酶切位點，設計 1 對不含其序列中酶切位點的引物，并加保護堿基。引物序列如下： 上游引物： 5'-CGAGCTCATGT-CAACTGTCAAGGAG-3‘（下劃線部分為 Sac Ⅰ 酶切位點） ,下 游 引 物： 5'-CCTCGAGTTAAAATTCCA-GATCCTTTTG-3’（下劃線部分為 XhoⅠ酶切位點） .

以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反應條件和體系與1. 2. 2 相同。產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳驗證后，在紫外燈下切膠進行回收?；厥债a物經 SacⅠ和 XhoⅠ雙酶切后，與 pET-28a（+ ） 連接，連接反應總體積10 μL,其中目的基因 4. 5 μL、載體 0. 5 μL、SolutionI Buffer 5 μL,16 ℃ 連接過夜。

將連接產物轉化到 BL21（DE3） 中，涂布于含卡那霉素的 LB 固體培養基上，37 ℃孵育過夜。以挑取的單克隆菌落搖菌液為模板進行 PCR 擴增，參數同 1. 2. 2.經瓊脂糖凝膠電泳驗證判斷菌體是否含有重組質粒。提取質粒后進行 Sac Ⅰ和 Xho Ⅰ單雙酶切驗證，以觀察是否含有目的 DNA.重組質粒委托生工生物工程（上海） 股份有限公司進行測序。

1. 2. 5 重組蛋白誘導表達及檢測

取400 μL 過夜培養菌，接種于20 mL 含卡那霉素的 LB 培養基，37 ℃培養至 OD600約為 0. 4 ~0. 6,加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside,IPTG） 至終濃度為 1 mmol / L,28 ℃ 條件下誘導 5 h.取1 mL 菌液12 000 r/min 離心10 min 去上清，經磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS） 洗滌后加入 150 μL 蛋白緩沖液，煮沸 10 min,12 000 r/min離心取上清，10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium do-decyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE） 電泳鑒定。

用上述方法先進行 SDS-PAGE,再用半干電轉移系統將重組蛋白由凝膠轉印至硝酸纖維素膜上（轉移參數為 15 V × 30 min） .將硝酸纖維素膜置于含 1%牛血清蛋白的 PBS 中，4 ℃ 封閉過夜。用含 0. 05% Tween - 20 的 PBS 洗滌 3 次，每次 10min,加入 1∶ 1 000稀釋的抗 His-Tag 單克隆抗體，室溫下孵育 1 h,洗滌 3 次，加入 1∶ 20 000 稀釋的羊抗鼠 IgG-Biotin（二抗） ,室溫下孵育 l h.洗滌 3 次，再加入1∶ 1 000稀釋的 HRP-Sterptavidin,室溫下孵育 1h.用不含 Tween - 20 的 PBS 洗滌 5 次，每次 5 min,加入底物液（含 4-氯-1-萘酚） 顯色 5 ~ 10 min,蒸餾水沖洗以終止顯色。

2 結果與分析

2. 1 花鼠 LDH-C 基因 cDNA 克隆及重組載體的鑒定

以花鼠睪丸總 RNA 為模板，根據設計的特異性引物，利用 RT-PCR 擴增后經電泳檢測得到了一條約 1 000 bp 大小的 DNA 片段，經連接、轉化的重組載體進行藍白斑篩選后，挑取白色轉化菌落，以菌液為模板進行 PCR 驗證，瓊脂糖凝膠電泳驗證表明，得到與預期大小一致的片段長度（圖 1） .初步判斷已成功構建了測序載體。

2. 2 LDH-C 的序列分析及蛋白質結構分析

測序結果顯示，克隆的片段全長為999 bp,編碼一個完整的開放閱讀框（1 ~ 999） ,堿基組成為 A（28. 2%） 、T（30. 0%） 、C（17. 2%） 、G（24. 5%） .共編碼 332 個氨基酸，其中，亮氨酸（Leu） 、絲氨酸（Ser） 、纈氨酸（Val） 比例最高，均超過 10%,負電荷殘基（Asp + Glu） 與正電荷殘基（Arg + Lys） 均為 36個（圖 2） .

ProtParam 軟件分析結果顯示，花鼠 LDH-C 的理論分子量為 37 kD,理論等電點 PI 為 7. 04,GRA-VY（grand average of hydropathicity） 值為 0. 087.用SignalP 4. 1 預測信號肽結果表明 LDH-C 不存在信號肽，經 TMHMM 軟件分析推測 LDH-C 也不具有跨膜區，推測是一種非分泌、疏水性蛋白。

SOPMA 分析表明 α 螺旋、無規則卷曲以及延伸鏈是 LDH-C 蛋白二級結構的主要成分。LDH-C蛋白二級結構中含有 42. 47% α 螺旋、29. 82% 無規則卷曲、20. 78% 延伸鏈和 6. 93% β 轉角。通過Phyre2 同源建模得到花鼠 LDH-C 三維結構模型（圖 3） ,其中有 330 個氨基酸殘基與數據庫中一個LDH-C 蛋白結構模板相似度達 99% ,置信度為 100% .

2. 3 原核表達載體鑒定

重組載體經轉化后，進行單雙酶切，經 1% 瓊脂糖凝膠電泳驗證后得到如下結果（圖 4） .經 Sac Ⅰ和 Xho Ⅰ單酶切的載體均出現一條約 7 000 bp 條帶，雙酶切后的載體含有 2 條亮帶，其中一條與已知的 LDH-C 基因 DNA 相同，約 1 000 bp,另外一條帶略小于單酶切的條帶。初步判定重組表達載體構建成功。經生工生物工程（上海） 股份有限公司測序后，確定插入的 DNA 片段與已知 LDH-C 片段完全一致。

2. 4 重組蛋白誘導表達及鑒定

經鑒定的轉化菌，經 IPTG 誘導后，表達產物經10% SDS-PAGE 電泳，在 40 kD 附近出現了 1 條較濃的蛋白質區帶（圖 5-a） ,與預期的目的蛋白 37 kD分子量大小相符，攜帶空載體的菌體 IPTG 誘導前后未見菌體全蛋白變化。IPTG 誘導后的重組菌表達的一個蛋白質可以被抗 His-Tag 單克隆抗體識別（圖 5-b） ,從而顯示特異性蛋白區帶，其位置與誘導產物一致，表明 LDH-C 蛋白誘導表達成功。

3 討論

研究基于精子抗原的免疫不育疫苗是一種具有前景并能有效控制種群的方法 （Naz & Rajesh,2004） .免疫不育法是通過降低生育率控制種群數量，并且不育個體干擾種群繁殖，消耗資源，能夠有效控制種群恢復的速度（劉漢武等，2008） .LDH-C是精子能量代謝過程中的一個重要酶，其主要分布在精子胞質和線粒體基質內。Odet et al. （2008） 通過基因剔除的方法對缺失 LDH-C 的小鼠進行生育試驗發現，精子功能的缺失造成了極端的不育效果，推測是因為 LDH-C 缺失的精子在移動方式和移動時間上均受到極大限制。而體外受精試驗也表明，缺失 LDH-C 基因的精子不能使卵子受精。這也表明 LDH-C 基因是研究花鼠免疫不育疫苗極好的研究對象。本研究在進行預試驗時，根據 6 種不同動物（小家鼠 Mus musculus、褐家鼠 Rattus norvegicus、高原鼢鼠 Myospalax baileyi、人 Homo sapiens、赤狐Vulpes vulpes、家兔 Oryctolagus cuniculus） 的 LDH-C 序列保守片段設計了簡并引物并獲得了 609 bp 花鼠LDH-C 片段，經 BLAST 比對顯示與多紋黃鼠相似度為 97%,因而嘗試以多紋黃鼠 LDH-C 序列編碼區為模板設計特異性引物，最終得到了花鼠 LDH-C 序列完整編碼區，經比對、驗證分析，表明其編碼的氨基酸序列含有 LDH-C 特有的保守序列元件。在將LDH-C 與 NCBI 數據庫中已經登錄的 14 種動物LDH-C 編碼的氨基酸序列進行多重比對，構建基于鄰接法的系統進化樹時，也發現花鼠 LDH-C 與已知的嚙齒鼠類動物具有較高的同源性。

本研究將 LDH-C 編碼序列插入原核表達載體pET28a（+） 多克隆位點的 SacⅠ與 XhoⅠ之間，構建了重組質粒 pET28a-sLDH-C.根據該載體閱讀框架特點，在插入序列的 5‘端上游存在 126 bp 的可讀序列，編碼 42 個氨基酸殘基，其中包括 6 個組氨酸殘基組成的 His-Tag.因此表達的 LDH-C 鏈實際上是一條融合的多肽鏈： 除 LDH-C 固有氨基酸序列外，N端有一小段附加序列。唐威華等（2000） 發現，由于組氨酸標簽攜帶較強的正電荷，降低了蛋白在 SDS-PAGE 中的電泳速率，從而導致表觀的分子量偏大，這也解釋了在 SDS-PAGE 電泳結果中，第 6 泳道的條帶比預計位置更加靠近 40 kD.因此，在研究含有組氨酸標簽的融合蛋白時，SDS-PAGE 電泳只能作為表達的初步檢測而不能作為蛋白分子量確定的依據，本研究后續試驗也將對此進行探索。