苔蘚植物能夠促使沼澤陸地化，儲蓄土壤水分，是其它陸生植物生長的開路先鋒者。東亞砂蘚（Racomitrium japonicum）屬于紫萼蘚科（Grimmiace）砂蘚屬（Racomitrium）植物，松散或密集叢生,主要生長在巖石表面的薄土和砂土上，因其具有極強的抗旱性而成為國內外研究的熱點。其中質膜蛋白在水分脅迫下的變化與其抗旱性有著密切的關系，當苔蘚受到干旱脅迫時，細胞膜的保護酶會構成防御系統，對抗逆境對細胞內部的傷害，因此，細胞質膜的提取將是苔蘚植物抗旱機理研究的重要一步。
植物細胞質膜不僅是細胞與環境間物質交換與信息傳遞的重要場所，且介導不同類型細胞的水分運輸，對水分的跨膜轉運及抗旱過程起著重要的作用。其中細胞質膜蛋白的分離是研究質膜對水分運輸作用的必要前提，目前，人們使用較多的質膜分離方法包括蔗糖密度梯度離心法和水雙相分配分離法，兩者的區別在于蔗糖密度梯度離心法是通過膜囊泡的大小和密度進行分離，而水雙相分配分離法是依據膜表面的特性進行分離。后者對實驗的外界條件要求較高，操作復雜，且不易出結果。而傳統的水通道蛋白分離方法是通過研磨破碎細胞組織，將細胞組織粗提液放在不同密度梯度的蔗糖勻漿液中離心、懸浮，從而得到細胞質膜蛋白。本實驗通過對傳統蔗糖密度梯度法的改進，使其操作相對簡便，樣品濃度提高且實驗成本降低，是一種更為高效、快速的質膜蛋白分離方法。
1、 材料與方法
1.1 實驗材料
東亞砂蘚植物于 2011 年采自五大連池風景區。
1.2 實驗試劑
EDTA、DTT、PMSF、PVPP、Na2CO3、SDS、TEMED、過硫酸銨、蔗糖等。
1.3 實驗設備
冷凍高速離心機、冷凍超速離心機、電泳儀、搖床、漩渦震蕩器。
2、 實驗方法
2.1 質膜蛋白粗提物的制備
將兩份相同質量的材料洗凈，一部分干旱脅迫，一部分正常培養 3d，分別取莖尖約 5g 放入預冷的研缽中，加入 0.3gPVPP，液氮中快速研磨至細粉末（研磨 40min 左右）。將粉末移入 30mL 離心管中，每管加入 15mL 預冷的勻漿液（勻漿液：50mL 勻漿液中加入 0.5mol·L-1EDTA0.2mL，0.5mol·L-1Tris5mL，1mol·L-1蔗糖 12.5mL，1mol·L-1DTT1mL，0.2mol·L-1PMSF0.25mL），漩渦器震蕩混勻。置于 4℃離心機中，轉速12000r/min（8000g）離心 15min，小心吸取上清液至新的離心管中，同樣轉速離心 15min，吸取上清液，再次離心，收集的上清液即為質膜蛋白粗提液。
2.2 質膜蛋白的分離
用 4℃超速冷凍離心機將膜蛋白粗提液以 100 000 g 的速度離心 1 h，棄去上清液，以預冷的 0.1mol·L-1Na2CO3溶液洗滌沉淀。玻璃勻漿器冰上勻漿 1min 后放入冰上靜止 20min，再置于超速冷凍離心機100 000g 離心 1 h。重復上步洗滌過程，棄上清，每管加入半濃度的勻漿液 30 mL（半濃度勻漿液：50 mL勻漿液中加入 0.5mol·L-1EDTA0.1mL，0.5mol·L-1Tris2.5mL，1mol·L-1蔗糖 6.25mL，1mol·L-1DTT0.5mL，0.2 mol·L-1PMSF0.12 mL）。重懸沉淀，勻漿器充分勻漿。100000g 超速離心 1h，棄上清，將沉淀懸浮于 500μL0.05mol·L-1Tris 溶液中。勻漿器勻漿，分裝保存于-20℃。
2.3 SDS-PAGE 凝膠電泳
利用變性不連續SDS-PAGE凝膠電泳方法對質膜蛋白的分離進行分析，配方如表1。待膠板凝固后，每個點樣空加入40 μL樣品和5μL溴酚藍指示劑混合液，開始電泳。調節電壓為130V，電流為50mA，大約2h，溴酚藍指示劑到達距低端1~2cm處時，終止電泳。將凝膠板取出，放入考馬斯亮藍染色液中染色1h，輕輕取出膠板置于脫色液中脫色12h，照相觀察。
3、 實驗結果
質膜蛋白粗提物制備過程中的一個重要步驟是組織勻漿液的選擇，其中，Yoshida等人在勻漿液中加入了0.01mol·L-1乙二醇四乙酸（EGTA），本實驗以0.5 mol·L-1EDTA作為代替，EDTA與金屬離子形成配合物的穩定性較強，可以更大程度地減少對磷脂酶的毒害作用。其次，Tris溶液是廣泛用作核酸和蛋白質的溶劑,可除去水溶性的雜質\\(多糖類，核酸等\\)，也是質膜蛋白的溶解劑。為了抑制蛋白酶和脂加氧酶的活性，本文加入了0.2mol·L-1PMSF溶液，抗氧化劑DTT和酚類物質吸附劑PVPP，作用是減少植物中酚類物質氧化造成的干擾，盡量保證在制備膜蛋白粗提取物中的酶和蛋白的活性不受影響。
本實驗通過對蔗糖密度梯度法的優化，成功分離濃度較高的東亞砂蘚質膜蛋白，如圖 1 所示，在 28kDa 處有條清晰可見的條帶，表明無論是正常生長的東亞砂蘚材料，還是干旱脅迫后的材料都可以從膜蛋白上分離出水通道蛋白，且分離的水通道蛋白含量較高，濃度較大，可以用做 Western Blot 蛋白表達分析及蛋白質組學等后續試驗。
4、 討論
植物質膜蛋白在細胞轉錄水平、水通道蛋白的膜運輸、轉錄后水平等多方面都起到調控作用，例如植物氣孔的開閉，細胞膨壓，種子萌發、栓塞修復等都需要質膜蛋白的參與。此外，植物的逆境脅迫響應（如干旱、低溫、鹽分）也與許多質膜蛋白有密切關系，李勤報等研究發現小麥的根部及葉片在干旱脅迫下ATPase分解的活性升高，過氧化物酶活性升高，有利于植物在逆境中生存。
如今，質膜蛋白已在分子方面進行了大量的研究，而蛋白質組方向的研究相對較少，主要原因包括質膜蛋白的分離比較困難，因此，對其分離方法的優化將有助于細胞質膜蛋白在表達調控等方面的進一步研究。
主要的植物質膜蛋白分離方法包括蔗糖密度梯度離心法和水雙相分配分離法，其中水雙相分配分離法中兩相體系的組分、分配條件和操作步驟等不同制備條件以及不同的植物材料對質膜的分離效果都會有較大的影響。蔗糖密度梯度離心法相比之下，操作簡便，純度較高。但傳統的蔗糖密度梯度離心法需要制備蔗糖梯度，顆粒在兩種不同濃度梯度中的擴散是不可避免的，且加樣和離心時梯度易被破壞，因此本實驗在以下幾個方面對蔗糖密度梯度離心法進行了改進。
（1）研磨材料時，將材料放在預冷的研缽中，液氮下充分研磨置粉末，若細胞破碎不徹底,將影響細胞膜蛋白的分離。
（2）傳統的蔗糖密度梯度離心法用四層紗布過濾后離心，不僅會有少數膜蛋白流失，同時膜蛋白的提取過程中要盡量保持低溫，紗布過濾會影響勻漿液的溫度，對膜蛋白產生影響。我們采用振蕩器充分震蕩，經過 3 次低溫低速離心，除去雜質，保留濃度較高的膜蛋白粗提物。
（3）勻漿液的選擇是分離膜蛋白的重要步驟之一，本實驗采用了濃度較高的 EDTA 代替 EGTA，減少了對磷脂酶的毒害性，同時，加入了 PMSF、DTT 等抗氧化劑以減少蛋白粗提物中對酶和蛋白活性的影響。
（4）傳統的蔗糖密度梯度離心法將膜蛋白粗提液鋪在兩種不同濃度的蔗糖溶液上，加樣和離心過程中粗提液易擴散，從而破壞蔗糖梯度，所以本實驗用帶有蔗糖的勻漿液進行膜蛋白粗提物的提取，再用半濃度的勻漿液分離水通道蛋白，如此避免了梯度離心對水通道蛋白分離產生的影響。
植物細胞質膜蛋白是近年來蛋白質組學研究的一個熱點。通過對蔗糖密度梯度離心法的優化，使質膜蛋白最大程度的釋放出來，減少了細胞質蛋白的污染，同時，本實驗室已利用該方法成功提取丁香水通道蛋白，條帶清晰，且濃度較高，說明該方法重復性好，可用于其它植物的水通道蛋白的分離。為水通道蛋白質的進一步研究奠定基礎。
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