原標題：基于不同方法測定土壤酸性磷酸酶活性的比較
摘 要：土壤酸性磷酸酶與有機磷的礦化及植物的磷素營養關系最為密切。目前國內學者在測定酸性磷酸酶活性時主要參照關松蔭《土壤酶及其研究法》中以磷酸苯二鈉為基質的測定方法，而國外學者主要參照Dick《Methods of Soil Enzymology》中以對硝基苯磷酸二鈉為基質的測定方法（PNPP）。但是，在以磷酸苯二鈉為基質測定生成物的過程中，常出現顯色程度不明顯的問題；另外，采用不同基質測定酸性磷酸酶活性也造成了測定方法選擇的困難。為合理選擇土壤酸性磷酸酶活性的測定方法，本研究選用酸性、中性和堿性土壤各10個土樣，分別采用以磷酸苯二鈉為基質，且在顯色階段分別加入p H5.0醋酸鹽緩沖液（DPP 1）和p H9.4硼酸鹽緩沖液（DPP 2）的方法，以及PNPP方法測定土壤酸性磷酸酶活性。同時也研究了不同p H緩沖液和苯酚濃度對生成物顯色反應的影響。結果表明：以磷酸苯二鈉為基質、在顯色反應階段加入p H≤6的緩沖液時，苯酚和2,6-二溴苯醌氯亞胺不顯色；當加入p H≥8的緩沖液時，兩者之間顯色且苯酚濃度和吸光值的Pearson相關系數極顯著。這說明p H低是導致高苯酚濃度和2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色效果差的一個主要原因。此外，采用PNPP方法測定時，在酸性、中性和堿性土壤中， 10個樣本酸性磷酸酶活性的變異系數分別較DPP 2增加了70.04%、42.44%和21.17%;極差分別是DPP 2的27.18倍、26.85倍和39.43倍?？傊?，如果選用磷酸苯二鈉為基質測定土壤酸性磷酸酶活性，應在顯色階段加入堿性硼酸鹽緩沖液；選用對硝基苯磷酸二鈉為基質，是更為簡單和靈敏的方法。
關鍵詞：土壤 酸性磷酸酶活性 磷酸苯二鈉 對硝基苯磷酸二鈉 p H 顯色
土壤磷為植物生長必需的營養元素之一，其中有機磷所占比例達15%~80%[1].由于有機磷不能被植物直接吸收利用，從而成為陸地生態系統一個主要的限制養分[2].磷酸酶可催化磷酸脂或磷酸酐的水解， 其活性的高低直接影響有機磷的分解轉化及其生物有效性。其中酸性磷酸單酯酶與有機磷的礦化及植物的磷素營養關系最為密切[3-4],且在酸性土壤中占優勢[5].
酶的提取比較困難，對磷酸酶活性的測定主要是根據一定量的基質在酶催化反應過程中生成物或剩余底物量間接測得[6-7].自Kroll等最早提出用磷酸苯酯作基質，以酚的釋放量表示磷酸酶活性以來[6], 對土壤磷酸酶活性測定方法的改進主要圍繞基質以及緩沖液的種類進行。已報道采用的基質包括天然的基質（主要是核酸）、β-萘基磷酸鈉、β-甘油磷酸鹽、磷酸苯二鈉、對硝基酚磷酸鈉和酚酞磷酸鹽等[8-10].由于傳統的分光比色測定方法成本低， 較熒光比色更具有普遍性。本研究主要關注適用于分光比色的磷酸酶基質。
在分光比色方法中，目前國際上大部分學者使用對硝基苯磷酸二鈉為基質測定磷酸酶的活性， 且有研究表明該方法是最快速且準確的[9,11].有外文統計， 在磷酸酶的動力學特征研究中，有706個數據使用對硝基苯磷酸二鈉為基質，而只有140個數據使用其他基質[12].此外，目前我國學者在研究中經常用到的基質是磷酸苯二鈉[13].雖早期有研究表明，在p H 6.5條件下采用磷酸苯二鈉測定磷酸酶活性時存在顯色不穩定的問題[11,14], 但此測定方法已收錄在一些參考書中[15-18].且目前在中國知網上可查閱到不少使用該基質的文獻[19-20], 在Science Direct網也有個別文獻[21-22].
由于以磷酸苯二鈉為基質測定磷酸酶活性的原理是基于磷酸苯二鈉經磷酸酶水解后形成的酚， 在堿性條件下與顯色劑2,6-二溴苯醌氯亞胺反應， 在酚羥基的對位引入醌亞胺生色基而生成蘭色的靛酚鹽[23-24].目前國內部分參考書在描述土壤酸性磷酸酶活性的測定方法時提到在培養以及顯色時均要加入醋酸鹽緩沖液， 使苯酚與2,6-二溴苯醌氯亞胺在酸性條件下反應[16-18].但是《Methods in SoilBiology》中提到培養時加入醋酸鹽緩沖液， 而顯色時加入硼酸鹽緩沖液， 使最終顯色反應在堿性環境中進行[25].國內大部分學者所參考的關松蔭的《土壤酶及其研究法》中， 在介紹土壤磷酸酶活性的測定方法時， 描述為測定酸性磷酸酶活性需采用酸性醋酸鹽緩沖液培養， 而在顯色過程中只提到加入緩沖液， 具體是硼酸鹽緩沖液還是醋酸鹽緩沖液， 并未具體說明[15].此外， 本文作者和其他學者前期相關工作表明， 在采用磷酸苯二鈉為基質加醋酸鹽緩沖液顯色的過程中出現不顯色而影響酶活性測定的現象。故本研究以測定酸性磷酸酶活性時，酸性條件下不利于苯酚與2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色為假設， 選用酸性、中性和堿性土壤來比較基于磷酸苯二鈉為基質在不同酸堿緩沖液條件下的顯色反應， 同時把基于磷酸苯二鈉為基質測定酸性磷酸酶活性的方法與對硝基苯磷酸二鈉為基質的測定方法進行靈敏性比較， 探討基質對土壤酸性磷酸酶活性測定準確性和靈敏性的影響。研究結果可為土壤酸性磷酸酶活性的測定以及方法的選擇提供依據， 對改善土壤磷素營養狀況具有重要意義。
1 材料與方法
1.1供試土壤
在土壤生物指標的研究中， 不能僅根據土壤 p H的高低， 就簡單地選擇酸性磷酸酶或堿性磷酸酶單項指標， 在非酸性土壤中也可以利用酸性磷酸酶活性作為微生物活動和功能的指標。為研究不同類型的土壤對不同方法的敏感程度， 本研究選擇 p H 在4~10 范圍的 3 類土壤各 10 個土樣來測定不同土樣之間酸性磷酸酶活性的極差和變異系數。酸性土壤采自江西省分宜縣大崗山地區， p H 為 4.32~4.46, 土壤類型是紅壤， 植被類型是天然常綠闊葉林； 中性土壤采自北京八達嶺林場， p H 為 6.26~7.35, 土壤類型是棕壤， 植被類型主要是油松（Pinus tabulaeformisCarr.）； 堿性土壤采自海拔 4 200 m 以上的青海果洛藏族自治州瑪多瑪查理鎮， p H 為 9.59~10.05, 土壤類型是草甸土， 植被類型以草原為主。
1.2土壤酸性磷酸酶活性的測定方法
以磷酸苯二鈉（C6H5Na2O4P, CAS 編號 : 3279-54-7）為基質的測定方法依據中國學者廣泛參考的《土壤酶及其研究法》的方法[15]略作修改， 采用兩個方法進行酸性磷酸酶活性的測定： 一種是在顯色時同書中介紹的加磷酸苯二鈉溶液的方法一致， 加入酸性醋酸鹽緩沖液（DPP 1）； 另一種是顯色時加入堿性硼酸鹽緩沖液（DPP 2）， 兩種緩沖液的配制以及操作步驟參照書中所介紹的方法[15].
以對硝基苯磷酸二鈉（C6H4NNa2O6P·6H2O, CAS編號： 4264-83-9）為基質的方法參照《Methods of SoilEnzymology》中介紹的方法（PNPP）[11].稱取1.00 g土壤后以甲苯為抑制劑， 添加4 m L p H 6.5改進的通用的緩沖液[每升緩沖液中含有12.1 g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3）， 11.6 g 馬來酸 （C4H4O4）， 14.0 g 檸 檬 酸（C6H8O7）， 6.3 g 硼 酸 （H3BO3） 和 19.52 g 氫 氧 化 鈉（Na OH）], 和1 m L對硝基苯磷酸二鈉基質溶液后于37℃下培養1 h.培養結束后， 添加Ca Cl2和Na OH溶液， 并將濾液于400 nm處比色測定。
按文獻介紹的方法對照試驗有所差異： DPP 1和DPP 2設立無基質對照和無土壤對照； PNPP設立后加基質對照。為消除空白差異對結果的影響， 本研究統一設立無基質對照和無土壤對照。經測定， DPP 1、DPP 2 和 PNPP 無土壤對照吸光值分別是 0.070、0.112和0.108.
1.3緩沖液p H和苯酚濃度對顯色反應影響的測定
為了解不同p H緩沖液對不同濃度苯酚和2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色形成蘭色靛酚鹽的影響， 采用p H分別為4.0、6.0、8.0的醋酸鹽緩沖液和p H 10.0的硼酸鹽緩沖液測定苯酚濃度分別為0 μg·m L-1、1 μg·m L-1、2 μg·m L-1、3 μg·m L-1、4 μg·m L-1和6 μg·m L-1的吸光值。每個處理3次重復。
1.4數據統計分析
吸光值數據采用平均值±標準差表示。不同土樣吸光值的差異， 采用SPSS 18.0進行LSD差異性檢驗。不同p H緩沖液下不同苯酚濃度的吸光值采用雙因素交互作用分析。苯酚以及對硝基酚濃度與吸光值的關系采用Pearson相關分析。此外， 利用Matlab R2010b做圖。
2 結果與分析
2.1不同方法的標準曲線
用DPP 1測定， 當苯酚濃度為1.8 μg·m L-1時， 吸光值達到最大值（0.002）； 而苯酚濃度為0.6 μg·m L-1時， 吸光值達到最小值（-0.003）（表1）。經Pearson相關分析顯示， 6個苯酚濃度與所測吸光值之間的相關系數為0.284, 相關性不顯著。
圖1顯示， 隨著苯酚濃度的增加， 吸光值逐漸增加。DPP 2測定時， 苯酚濃度與吸光值之間的Pearson相關系數為0.997; PNPP測定時， 對硝基酚濃度與所測吸光值之間的Pearson相關系數為1.000.均在0.01水平上顯著相關。
2.2不同方法吸光值的比較
2.2.1酸性土壤中酸性磷酸酶活性的吸光值
由于用DPP 1測定時苯酚濃度與吸光值之間的Pearson相關系數不顯著， 也就無法得到滿意的標準曲線， 即無法計算生成物苯酚的濃度。而在酸性磷酸酶活性的計算過程中需要用到苯酚濃度， 從而造成了酸性磷酸酶活性計算的困難。因此， 本研究統一采用吸光值指標進行不同土樣之間的差異性比較。從表2中可知， 用DPP 1測定酸性磷酸酶活性時， 10個土樣吸光值之間差異不大， 平均吸光值為0, 土樣4最大值和土樣3最小值之間僅相差0.008; 用DPP 2測定時， 吸光值介于0.089和0.045之間； 用PNPP測定時，吸光值介于1.887和0.691之間， 極差為1.196, 是DPP 2的27.18倍。此外， PNPP測定時， 10個土樣吸光值之間的變異系數為39.67%, 較DPP 2增加70.04%.
如果只考慮無基質對照吸光值， 用DPP 1測定時， 10個土樣的吸光值出現4個負值， 而用DPP 2和PNPP測定時， 不存在負值； 同時考慮無基質和無土壤對照， 用DPP 1和DPP 2測定所測土樣結果全部為負值， 而用PNPP測定無負值。
摘 要：土壤酸性磷酸酶與有機磷的礦化及植物的磷素營養關系最為密切。目前國內學者在測定酸性磷酸酶活性時主要參照關松蔭《土壤酶及其研究法》中以磷酸苯二鈉為基質的測定方法，而國外學者主要參照Dick《Methods of Soil Enzymology》中以對硝基苯磷酸二鈉為基質的測定方法（PNPP）。但是，在以磷酸苯二鈉為基質測定生成物的過程中，常出現顯色程度不明顯的問題；另外，采用不同基質測定酸性磷酸酶活性也造成了測定方法選擇的困難。為合理選擇土壤酸性磷酸酶活性的測定方法，本研究選用酸性、中性和堿性土壤各10個土樣，分別采用以磷酸苯二鈉為基質，且在顯色階段分別加入p H5.0醋酸鹽緩沖液（DPP 1）和p H9.4硼酸鹽緩沖液（DPP 2）的方法，以及PNPP方法測定土壤酸性磷酸酶活性。同時也研究了不同p H緩沖液和苯酚濃度對生成物顯色反應的影響。結果表明：以磷酸苯二鈉為基質、在顯色反應階段加入p H≤6的緩沖液時，苯酚和2,6-二溴苯醌氯亞胺不顯色；當加入p H≥8的緩沖液時，兩者之間顯色且苯酚濃度和吸光值的Pearson相關系數極顯著。這說明p H低是導致高苯酚濃度和2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色效果差的一個主要原因。此外，采用PNPP方法測定時，在酸性、中性和堿性土壤中， 10個樣本酸性磷酸酶活性的變異系數分別較DPP 2增加了70.04%、42.44%和21.17%;極差分別是DPP 2的27.18倍、26.85倍和39.43倍?？傊?，如果選用磷酸苯二鈉為基質測定土壤酸性磷酸酶活性，應在顯色階段加入堿性硼酸鹽緩沖液；選用對硝基苯磷酸二鈉為基質，是更為簡單和靈敏的方法。
關鍵詞：土壤 酸性磷酸酶活性 磷酸苯二鈉 對硝基苯磷酸二鈉 p H 顯色
土壤磷為植物生長必需的營養元素之一，其中有機磷所占比例達15%~80%[1].由于有機磷不能被植物直接吸收利用，從而成為陸地生態系統一個主要的限制養分[2].磷酸酶可催化磷酸脂或磷酸酐的水解， 其活性的高低直接影響有機磷的分解轉化及其生物有效性。其中酸性磷酸單酯酶與有機磷的礦化及植物的磷素營養關系最為密切[3-4],且在酸性土壤中占優勢[5].
酶的提取比較困難，對磷酸酶活性的測定主要是根據一定量的基質在酶催化反應過程中生成物或剩余底物量間接測得[6-7].自Kroll等最早提出用磷酸苯酯作基質，以酚的釋放量表示磷酸酶活性以來[6], 對土壤磷酸酶活性測定方法的改進主要圍繞基質以及緩沖液的種類進行。已報道采用的基質包括天然的基質（主要是核酸）、β-萘基磷酸鈉、β-甘油磷酸鹽、磷酸苯二鈉、對硝基酚磷酸鈉和酚酞磷酸鹽等[8-10].由于傳統的分光比色測定方法成本低， 較熒光比色更具有普遍性。本研究主要關注適用于分光比色的磷酸酶基質。
在分光比色方法中，目前國際上大部分學者使用對硝基苯磷酸二鈉為基質測定磷酸酶的活性， 且有研究表明該方法是最快速且準確的[9,11].有外文統計， 在磷酸酶的動力學特征研究中，有706個數據使用對硝基苯磷酸二鈉為基質，而只有140個數據使用其他基質[12].此外，目前我國學者在研究中經常用到的基質是磷酸苯二鈉[13].雖早期有研究表明，在p H 6.5條件下采用磷酸苯二鈉測定磷酸酶活性時存在顯色不穩定的問題[11,14], 但此測定方法已收錄在一些參考書中[15-18].且目前在中國知網上可查閱到不少使用該基質的文獻[19-20], 在Science Direct網也有個別文獻[21-22].
由于以磷酸苯二鈉為基質測定磷酸酶活性的原理是基于磷酸苯二鈉經磷酸酶水解后形成的酚， 在堿性條件下與顯色劑2,6-二溴苯醌氯亞胺反應， 在酚羥基的對位引入醌亞胺生色基而生成蘭色的靛酚鹽[23-24].目前國內部分參考書在描述土壤酸性磷酸酶活性的測定方法時提到在培養以及顯色時均要加入醋酸鹽緩沖液， 使苯酚與2,6-二溴苯醌氯亞胺在酸性條件下反應[16-18].但是《Methods in SoilBiology》中提到培養時加入醋酸鹽緩沖液， 而顯色時加入硼酸鹽緩沖液， 使最終顯色反應在堿性環境中進行[25].國內大部分學者所參考的關松蔭的《土壤酶及其研究法》中， 在介紹土壤磷酸酶活性的測定方法時， 描述為測定酸性磷酸酶活性需采用酸性醋酸鹽緩沖液培養， 而在顯色過程中只提到加入緩沖液， 具體是硼酸鹽緩沖液還是醋酸鹽緩沖液， 并未具體說明[15].此外， 本文作者和其他學者前期相關工作表明， 在采用磷酸苯二鈉為基質加醋酸鹽緩沖液顯色的過程中出現不顯色而影響酶活性測定的現象。故本研究以測定酸性磷酸酶活性時，酸性條件下不利于苯酚與2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色為假設， 選用酸性、中性和堿性土壤來比較基于磷酸苯二鈉為基質在不同酸堿緩沖液條件下的顯色反應， 同時把基于磷酸苯二鈉為基質測定酸性磷酸酶活性的方法與對硝基苯磷酸二鈉為基質的測定方法進行靈敏性比較， 探討基質對土壤酸性磷酸酶活性測定準確性和靈敏性的影響。研究結果可為土壤酸性磷酸酶活性的測定以及方法的選擇提供依據， 對改善土壤磷素營養狀況具有重要意義。
1 材料與方法
1.1供試土壤
在土壤生物指標的研究中， 不能僅根據土壤 p H的高低， 就簡單地選擇酸性磷酸酶或堿性磷酸酶單項指標， 在非酸性土壤中也可以利用酸性磷酸酶活性作為微生物活動和功能的指標。為研究不同類型的土壤對不同方法的敏感程度， 本研究選擇 p H 在4~10 范圍的 3 類土壤各 10 個土樣來測定不同土樣之間酸性磷酸酶活性的極差和變異系數。酸性土壤采自江西省分宜縣大崗山地區， p H 為 4.32~4.46, 土壤類型是紅壤， 植被類型是天然常綠闊葉林； 中性土壤采自北京八達嶺林場， p H 為 6.26~7.35, 土壤類型是棕壤， 植被類型主要是油松（Pinus tabulaeformisCarr.）； 堿性土壤采自海拔 4 200 m 以上的青海果洛藏族自治州瑪多瑪查理鎮， p H 為 9.59~10.05, 土壤類型是草甸土， 植被類型以草原為主。
1.2土壤酸性磷酸酶活性的測定方法
以磷酸苯二鈉（C6H5Na2O4P, CAS 編號 : 3279-54-7）為基質的測定方法依據中國學者廣泛參考的《土壤酶及其研究法》的方法[15]略作修改， 采用兩個方法進行酸性磷酸酶活性的測定： 一種是在顯色時同書中介紹的加磷酸苯二鈉溶液的方法一致， 加入酸性醋酸鹽緩沖液（DPP 1）； 另一種是顯色時加入堿性硼酸鹽緩沖液（DPP 2）， 兩種緩沖液的配制以及操作步驟參照書中所介紹的方法[15].
以對硝基苯磷酸二鈉（C6H4NNa2O6P·6H2O, CAS編號： 4264-83-9）為基質的方法參照《Methods of SoilEnzymology》中介紹的方法（PNPP）[11].稱取1.00 g土壤后以甲苯為抑制劑， 添加4 m L p H 6.5改進的通用的緩沖液[每升緩沖液中含有12.1 g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3）， 11.6 g 馬來酸 （C4H4O4）， 14.0 g 檸 檬 酸（C6H8O7）， 6.3 g 硼 酸 （H3BO3） 和 19.52 g 氫 氧 化 鈉（Na OH）], 和1 m L對硝基苯磷酸二鈉基質溶液后于37℃下培養1 h.培養結束后， 添加Ca Cl2和Na OH溶液， 并將濾液于400 nm處比色測定。
按文獻介紹的方法對照試驗有所差異： DPP 1和DPP 2設立無基質對照和無土壤對照； PNPP設立后加基質對照。為消除空白差異對結果的影響， 本研究統一設立無基質對照和無土壤對照。經測定， DPP 1、DPP 2 和 PNPP 無土壤對照吸光值分別是 0.070、0.112和0.108.
1.3緩沖液p H和苯酚濃度對顯色反應影響的測定
為了解不同p H緩沖液對不同濃度苯酚和2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色形成蘭色靛酚鹽的影響， 采用p H分別為4.0、6.0、8.0的醋酸鹽緩沖液和p H 10.0的硼酸鹽緩沖液測定苯酚濃度分別為0 μg·m L-1、1 μg·m L-1、2 μg·m L-1、3 μg·m L-1、4 μg·m L-1和6 μg·m L-1的吸光值。每個處理3次重復。
1.4數據統計分析
吸光值數據采用平均值±標準差表示。不同土樣吸光值的差異， 采用SPSS 18.0進行LSD差異性檢驗。不同p H緩沖液下不同苯酚濃度的吸光值采用雙因素交互作用分析。苯酚以及對硝基酚濃度與吸光值的關系采用Pearson相關分析。此外， 利用Matlab R2010b做圖。
2 結果與分析
2.1不同方法的標準曲線
用DPP 1測定， 當苯酚濃度為1.8 μg·m L-1時， 吸光值達到最大值（0.002）； 而苯酚濃度為0.6 μg·m L-1時， 吸光值達到最小值（-0.003）（表1）。經Pearson相關分析顯示， 6個苯酚濃度與所測吸光值之間的相關系數為0.284, 相關性不顯著。
圖1顯示， 隨著苯酚濃度的增加， 吸光值逐漸增加。DPP 2測定時， 苯酚濃度與吸光值之間的Pearson相關系數為0.997; PNPP測定時， 對硝基酚濃度與所測吸光值之間的Pearson相關系數為1.000.均在0.01水平上顯著相關。
2.2不同方法吸光值的比較
2.2.1酸性土壤中酸性磷酸酶活性的吸光值
由于用DPP 1測定時苯酚濃度與吸光值之間的Pearson相關系數不顯著， 也就無法得到滿意的標準曲線， 即無法計算生成物苯酚的濃度。而在酸性磷酸酶活性的計算過程中需要用到苯酚濃度， 從而造成了酸性磷酸酶活性計算的困難。因此， 本研究統一采用吸光值指標進行不同土樣之間的差異性比較。從表2中可知， 用DPP 1測定酸性磷酸酶活性時， 10個土樣吸光值之間差異不大， 平均吸光值為0, 土樣4最大值和土樣3最小值之間僅相差0.008; 用DPP 2測定時， 吸光值介于0.089和0.045之間； 用PNPP測定時，吸光值介于1.887和0.691之間， 極差為1.196, 是DPP 2的27.18倍。此外， PNPP測定時， 10個土樣吸光值之間的變異系數為39.67%, 較DPP 2增加70.04%.
如果只考慮無基質對照吸光值， 用DPP 1測定時， 10個土樣的吸光值出現4個負值， 而用DPP 2和PNPP測定時， 不存在負值； 同時考慮無基質和無土壤對照， 用DPP 1和DPP 2測定所測土樣結果全部為負值， 而用PNPP測定無負值。
