硝化和反硝化是土壤中氮素損失的潛在途徑. 隨著人類活動的加劇, 土壤中的硝化和反硝化作用會向大氣中釋放更多的溫室氣體氧化亞氮. 由人為活動所產生的氧化亞氮中, 耕地土壤的釋放量貢獻了65%左右[1]. 反硝化作用\\(denitrification\\)是指把硝酸鹽等較復雜的含氮化合物轉化為氮氣 、 一氧化氮和二氧化氮的過程, 這是厭氧條件下\\(>60%的土壤孔隙水含量\\)陸地氧化亞氮產生的主要生物過程. 在過去的 1 個多世紀里, 人們通常認為反硝化過程都是由進行無氧呼吸的細菌進行的, 但近年來的研究發現, 真菌也可以進行反硝化作用[2]. 在分離獲得的真菌中, 已經發現很多種具有產生氧化亞氮的能力.

雖然在純培養條件下, 真菌產生氧化亞氮活性與細菌相比要低幾個數量級[3], 但是對土壤氧化亞氮產生能力的測定結果表明, 真菌產氧化亞氮的能力遠超細菌[4-5]. Laughlin 等[4]研究表明: 在草地及耕作泥炭土中使用放線菌酮抑制真菌活性時, 土壤氧化亞氮排放通量減少了 80%, 而用鏈霉素抑制土壤細菌活性后, 土壤氧化亞氮排放通量僅減少 30%左右. 真菌在土壤氧化亞氮排放中的重要貢獻可能是由于其生物量在土壤微生物中占據著非常大的優勢. 土壤原位氧化亞氮排放通量與土壤真菌生物量呈顯著正相關,而與反硝化細菌及其他土壤性質沒有明顯的相關[6]. 已經有一些關于草地、 濕地以及耕地等生態系統土壤真菌氧化亞氮排放的研究, 但是對于林地土壤的研究尚不多見[4-5, 7-8]. 部分經濟林的集約經營程度越來越高, 它們對土壤微生物, 特別是對土壤真菌的干擾也非常劇烈. 由于真菌可以耐受更低的 pH 值,且在林地土壤中的生物量也往往高于細菌, 因此真菌在南方酸性森林土壤氧化亞氮排放過程中可能具有更大的貢獻[9-10]. 毛竹 Phyllostachy edulis 是中國南方的主要竹種[11], 地下根鞭發達, 穿透能力極強, 可以幫助毛竹不斷向周邊森林蔓延并替代原有森林. 此外, 毛竹林的經濟價值較高, 目前農戶對其的集約經營程度也在不斷提高. 由于真菌對人為干擾較為敏感, 原有天然林改變為毛竹林必將導致土壤真菌群落結構的變化, 進而導致土壤氧化亞氮排放通量的改變. 本研究利用選擇性抑制方法, 研究毛竹林及闊葉林土壤細菌及真菌對氧化亞氮排放的貢獻率, 揭示不同微生物在林地土壤溫室氣體排放中的作用及其影響機制, 從而對闊葉林演變成毛竹林進行生態風險評估, 為合理經營毛竹林, 減少溫室氣體排放提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在浙江省臨安市天目山國家級自然保護區進行野外調查, 在相似地形地貌條件下分別選取 4 塊毛竹林地\\(moso bamboo forest, MB\\)和 4 塊闊葉林地\\(broad-leaved forest, BL\\). 所有樣地土壤均為花崗巖發育的紅壤, 毛竹林地土壤為粉黏土\\(黏粒 43.27%, 粉粒 40.34%, 砂粒 16.39%\\), 闊葉林地土壤為粉黏壤土\\(黏粒 38.50%, 粉粒 48.68%, 砂粒 12.82%\\). 采用 5 點采樣法采取土樣, 采集表層\\(0~20 cm\\)土壤,裝入自封袋帶回實驗室. 去除大的動植物殘體及石礫后, 樣品過 2 mm 鋼篩混勻, 四分法后棄去多余樣品. 樣品分為 2 份, 1 份立即進行室內培養試驗和磷脂脂肪酸分析, 另 1 份風干后測定土壤 pH 值、 有機質、 全氮質量分數等基本理化性質.

1.2 試驗設置

混合后的新鮮土樣用于室內培養試驗, 測定細菌及真菌對土壤氧化亞氮排放通量的貢獻率. 試驗共分為 4 個處理: ①對照\\(control\\), 不添加任何抗生素; ②鏈霉素\\(streptomycin, strep\\), 土壤中添加 1.0mg·g-^1的鏈霉素;③放線菌酮\\(cycloheximide, cyclo\\), 土壤添加 2.0 mg·g-1放線菌酮;④鏈霉素+放線菌酮\\(both\\), 土壤中同時添加 1.0 mg·g^-1的鏈霉素和 2.0 mg·g^-1放線菌酮. 重復 3 次·土樣^-1.

1.3 試驗方法

1.3.1 土樣培養試驗 稱取相當于 20.0 g 干質量的新鮮土壤放進 150 mL 棕色試劑瓶中, 加入 4.0 mL 不同抗生素溶液\\(對照僅加去離子水\\)使土壤抗生素質量分數達到試驗設計要求. 試劑瓶裝好土樣后, 先在4 ℃條件下過夜預培養, 以使抗生素逐漸擴散至整個土壤空隙中. 之后, 將試劑瓶移至室溫培養, 向土壤中分別加入 100 mmol·L^-1葡萄糖和 100 mmol·L^-1硝酸鉀, 使土壤含水量達到田間最大持水量的 90%左右. 將試劑瓶用塞上橡膠塞后, 向其中充體積分數為 10%的乙炔以抑制氧化亞氮繼續還原成氮氣. 將土樣與溶液充分混合后, 放在培養箱中 18 ℃培養 7 h 后, 開始用針筒抽取試劑瓶內氣體, 島津\\(GC-2014\\)氣相色譜測定氧化亞氮通量.

1.3.2 磷脂脂肪酸分析 新鮮樣品帶回實驗室后, 立即進行冷凍干燥, 測定土壤磷脂脂肪酸摩爾質量濃度. 磷脂脂肪酸測定參照 Wu 等[12]方法. 稱取 3.0 g 凍干土樣, 采用氯仿提取總磷脂后, 將樣品裝載硅膠柱\\(SPE-Si\\), 分別用氯仿、 丙酮和甲醇洗脫中性脂、 糖脂和極性磷脂. 將所有組分進行甲基化, 氯仿回收, 氮氣吹干后氣相色譜\\(安捷倫 6890N\\)測定. 總磷脂脂肪酸摩爾質量濃度用于表征土壤總微生物量. 細菌的代表性組分為: i15:0, a15:0, 15:0, i16:0, 16:1w7c, i17:0, a17:0, cy17:0, 17:0, 18:1w7c, cy19:0w8c; 真菌特征性脂肪酸為 18:2w6,9c[13]. 磷脂脂肪酸摩爾質量濃度以 nmol·g-1干土表示.

1.3.3 土壤理化性質分析 土壤有機質采用重鉻酸鉀外加熱法測定; 全氮采用凱氏法測定; 硝態氮和銨態氮采用氯化鉀浸提, 流動分析儀測定; 有效磷采用 Bray 法測定, 鹽酸-氟化銨溶液浸提, 比色法測定; 速效鉀采用乙酸銨提取-火焰光度法測定; pH 值采用 1∶2.5 土水比, 酸度計測定[14].

1.4 數據分析

采用 Excel 2007 和 SPSS 18.0 處理數據, Duncan 單因素方差分析法比較各處理之間的差異顯著性\\(P <0.05\\), 配對樣本 t 檢驗比較毛竹林與闊葉林土壤理化性質及土壤細菌與真菌反硝化能力的差異顯著性, 采用 Pearson 相關系數檢驗不同微生物氧化亞氮排放能力與土壤理化性質的相關關系.

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

所有樣地土壤均表現出不同程度的酸性, 而不同毛竹林及闊葉林樣地之間土壤 pH 值差異也較大.

分析結果表明: 毛竹林不同樣地土壤有機質、 全氮、 有效磷及硝態氮質量分數均沒有顯著差異, 而闊葉林不同樣地之間土壤有機質、 全氮及速效鉀也沒有顯著差異, 說明不同林分土壤有機質及全氮質量分數分布總體較為均一. 對比 2 種林分, 闊葉林土壤 pH 值顯著低于毛竹林\\(P<0.05\\), 而有機質與有效磷質量分數顯著高于毛竹林土壤\\(P<0.05\\). 相反, 毛竹林土壤速效鉀質量分數顯著高于闊葉林\\(P<0.05,表 1\\). 毛竹林入侵闊葉林或闊葉林人工演替為毛竹林后, 由于地上植被以及凋落物輸入的改變, 土壤理化性質也發生了相應的變化. 此外, 毛竹林人為干擾程度也在不斷增加, 如劈灌、 翻耕、 施肥以及伐竹等, 都會導致養分含量的改變, 如土壤有機質質量分數. 肖復明等[15]研究表明: 長期集約經營后, 毛竹林土壤有機碳逐漸下降. 而毛竹林土壤速效鉀高于闊葉林, 可能是由于人為施肥所造成的.

2.2 土壤微生物量

磷脂脂肪酸是幾乎所有活體微生物細胞膜的主要成分, 周轉速率極快且隨細胞死亡而迅速降解[16].因此, 本試驗采用土壤微生物總磷脂脂肪酸摩爾質量濃度作為土壤微生物量的指標, 可以最大限度地測定土壤中的活性微生物. 結果表明: 無論是總微生物量、 細菌及真菌生物量以及真菌/細菌比值, 毛竹林與闊葉林 2 種林分之間均沒有顯著差異. 同樣, 毛竹林的不同樣地之間也沒有顯著差異. 闊葉林土壤中, BL-4 樣地總微生物量與細菌生物量均顯著高于 BL^-1 樣地\\(P<0.05, 表 2\\). Pearson 相關分析表明:

真菌生物量與土壤 pH 值呈顯著負相關\\(R2=-0.752, P<0.05\\), 而與土壤有機質呈極顯著正相關 \\(R2=0.965, P<0.01\\); 細菌生物量與土壤速效磷顯著相關\\(R2=0.830, P<0.05\\), 而土壤真菌/細菌比值與硝態氮顯著相關\\(R2=0.815, P<0.05\\). 與細菌相比, 真菌可以適應更廣的 pH 值范圍, 且酸性 pH 值有利于真菌而不利于細菌的生長[17]. 因此, 在酸性的毛竹林和闊葉林土壤中, 真菌的活性相對較強. 有機質也是影響真菌的一個重要因素. 研究表明: 森林轉換為耕地之后導致土壤有機質降低, 進而降低林地土壤真菌生物量[18]. 與土壤有機質相似的是, 毛竹林真菌生物量與闊葉林相比有下降的趨勢, 盡管沒有顯著差異。

2.3 細菌及真菌氧化亞氮排放貢獻

不同林分土壤以及同一種林分不同樣地之間氧化亞氮的排放通量都存在較大差異, 其中毛竹林 MB-1 樣地土壤氧化亞氮排放通量最高, 其次是 MB-4, BL-3 及 BL-4 等樣地, MB-2 和 BL^-1, BL-2 等樣地的氧化亞氮排放通量最低\\(圖 1\\). 相關分析結果表明: 土壤氧化亞氮排放通量與本研究所選擇測定的部分土壤理化性質沒有顯著相關性. 土壤氧化亞氮排放與許多因素有關, 如土壤含水量、 容重、 pH 值、 有機質質量分數、 氮肥施用量等等[19]. 因此, 本研究中不同林分甚至同一林分不同樣地之間存在的巨大差異, 可能是由多種土壤環境因素共同決定的, 其影響因素還有待于進一步的研究. 統計結果表明: 毛竹林和闊葉林土壤氧化亞氮排放通量沒有顯著差異\\(t=-0.574, P=0.606\\). 在以往對森林土壤氧化亞氮排放通量的研究過程中, 往往將土壤溫度和濕度作為關鍵因子[20], 但近年來的研究則發現: 氮素水平是一個關鍵因素[21]. 對比 2 種不同林分, 無論是土壤全氮還是礦質態氮均沒有顯著差異\\(表 1\\), 這可能是 2 種林分氧化亞氮排放通量沒有差異的主要原因.

無論是單獨添加放線菌酮、 鏈霉素還是同時添加 2 種抗生素, 均顯著抑制了土壤氧化亞氮排放通量\\(P<0.05\\). 同時添加 2 種抗生素對土壤氧化亞氮排放通量的抑制率在 73%~83%, 但是同一林分的不同樣地之間沒有顯著差異, 而單獨添加鏈霉素或者放線菌酮的處理對土壤氧化亞氮排放通量的抑制率變化較大. 圖 2 結果表明: 在 2 種林分的樣地中, 除了個別樣地外\\(MB-2, BL^-1\\), 其他所有土壤真菌氧化亞氮排放通量均顯著高于細菌\\(P<0.05\\). 如在毛竹林土壤中, 真菌對土壤氧化亞氮排放的貢獻率為40.8%~56.2%, 遠高于細菌\\(9.0%~33.4%\\). 闊葉林土壤中也呈現同樣的規律, 真菌對土壤氧化亞氮排放貢獻率為 38.0%~62.8%, 而細菌的貢獻率為 12.6%~32.4%\\(圖 2\\). 目前, 已有研究表明, 在森林生態系統中的真菌群落對土壤氧化亞氮排放的貢獻要大于草地以及人為耕作的生態系統[4-5, 8]. 同時, 真菌與細菌對土壤氧化亞氮排放的貢獻比在不同的生態系統中存在著較大的差異[22]. 毛竹林與闊葉林由于其地上植被以及人為干擾程度不一樣, 真菌與細菌對土壤氧化亞氮排放的貢獻率也就存在著一定的差異.

與此類似的是, 在 2 種林分的不同樣地之間, 土壤真菌及細菌對氧化亞氮排放通量的貢獻率也有著顯著的差異\\(P<0.05\\). 如在毛竹林土壤中, 盡管氧化亞氮排放通量顯著低于樣地 MB-1\\(P<0.05\\), 但是MB-3 樣地的土壤真菌氧化亞氮排放貢獻率達到 56.2%, 顯著高于 MB-1 樣地真菌排放貢獻率\\(49.7%,P<0.05\\). 而在闊葉林土壤中, BL-3 和 BL-4 樣地土壤總氧化亞氮排放通量顯著高于\\(P<0.05\\)另外 2 個樣地的同時, 其真菌氧化亞氮排放貢獻率也顯著高于樣地 BL^-1 和 BL-2\\(P<0.05\\).將土壤氧化亞氮排放通量與所有土壤理化性質及微生物生物量進行 Pearson 相關分析. 結果表明:

真菌與細菌的氧化亞氮排放貢獻之間存在極顯著的相關性\\(P<0.01\\), 可能與 2 種微生物群落反硝化的環境條件要求較為相似有關. 值得注意的是, 真菌及細菌氧化亞氮排放通量與其生物量之間沒有顯著相關性, 說明生物量并非是決定氧化亞氮排放通量的關鍵因素. 由于只有一些特定的真菌即細菌種類可以進行反硝化作用, 如真菌中的鐮刀菌屬 Fusarium spp.具有較強的氧化亞氮釋放能力[23]. 因此, 真菌的氧化亞氮排放貢獻主要與真菌群落及特定種群的反硝化活性相關. 今后仍然需要從微生物物種多樣性以及功能基因豐度等方面來進一步研究土壤反硝化作用的主要貢獻者及其關鍵影響因素. 以往有研究結果表明: 真菌與細菌的氧化亞氮產生活性與土壤 pH 值關系較大, 這可能是由于 pH 值對這 2 種微生物數量及活性均有著重要的影響[22, 24]. 由于真菌可以適應非常寬的 pH 值范圍, 其受土壤 pH 值改變的影響相對細菌小, 而細菌生物量在酸性條件下可能會受到抑制, 因此在酸性土壤中真菌對氧化亞氮排放的貢獻就會大于細菌. 然而與以往結果不同的是, 本研究發現土壤真菌即細菌氧化亞氮排放通量與土壤 pH 值沒有顯著相關關系, 這可能與不同樣地之間 pH 值較為接近有關. 但是, 真菌氧化亞氮排放通量與土壤硝態氮含量有較強的負相關關系, 盡管并不顯著\\(R2=-0.673, P=0.067\\). 通常, 氧化亞氮通量與 NO3-N呈負相關關系. 隨著反硝化作用的進行, NO3-N 作為電子受體含量下降, 還原成氧化亞氮釋放出來[25].

3 結論與展望

抗生素選擇性抑制試驗結果表明: ①無論是毛竹林還是闊葉林, 真菌都是土壤氧化亞氮排放的主要貢獻者; ②闊葉林演替為毛竹林既沒有改變土壤氧化亞氮排放通量, 也沒有影響真菌及細菌對土壤氧化亞氮排放通量的相對貢獻率; ③真菌和細菌氧化亞氮排放特征相似, 但與生物量沒有相關性.

近年來, 毛竹林不斷替代闊葉林的同時, 經營強度也在不斷增加. 據統計, 有 40%~50%的毛竹林實行集約化栽培. 與天然狀態的粗放經營毛竹林相比, 集約經營毛竹林的典型特點表現為清除林下雜草, 土壤翻耕以及施用大量化肥等. 盡管集約經營措施可以一定程度上增加毛竹地上部的生物量, 提高碳儲量[26], 但也有研究表明, 使用化肥顯著增加了毛竹林土壤二氧化碳和氧化亞氮的排放通量, 且毛竹林土壤溫室氣體的排放速率隨著化肥施用量增加呈顯著增加趨勢[27], 但是其內在機制仍不清楚. 人為干擾如翻耕、 放牧以及氮肥施用等都會影響土壤真菌群落結構和功能[28], 繼而對土壤氧化亞氮排放產生潛在影響. 本研究中, 我們只是針對闊葉林和毛竹林進行了研究, 但是不同經營年限以及經營強度對毛竹林土壤真菌氧化亞氮相對排放貢獻的影響尚未涉及, 今后仍需在更加廣泛的范圍內針對人工經營毛竹林進行采樣, 并結合穩定性同位素標記手段來研究真菌在森林, 特別是人工經營森林生態系統氧化亞氮排放中的貢獻. 明確土壤真菌氧化亞氮排放相對貢獻及其對毛竹林人為經營的響應特征, 對于合理經營毛竹林, 控制全球氣候變化將具有十分重要的意義.

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