隨著人們對農業生產中長期、過量施用化肥所引起的諸如土壤板結、肥力下降、面源污染和pH值降低等農業生態環境問題的關注,微生物菌肥作為改善土壤營養狀況和提高植物抗逆性的作用越來越受到重視.
微生物菌肥是由一種或數種有益微生物經發酵而成的無毒害綠色生物性肥料.它通過施用于土壤后,菌肥中的微生物的生長可以礦化土壤有機養分,釋放土壤閉蓄態無機養分,從而改良土壤結構和提高土壤肥力,因此微生物肥料的施用改善植物的營養條件,協助農作物吸收養分,提高植物的抗逆性.
近年來,隨著生物技術的不斷發展,微生物肥料的研究與應用有了很大進展,但我國目前微生物肥料、生物添加劑市場種類繁多,由于氣候條件、地理環境和植株種類的不同,菌肥的施用效果差異很大.
雖然近年來我國建立起了一些規范對微生物肥料市場的法規和標準,但缺乏利用分子生物學技術來科學評價、有效監測菌肥施用效果.西藏地處我國西南邊陲,素以“世界屋脊”和“地球第三極”著稱.藏東南地區由于受高寒低溫等極端環境脅迫的影響,土壤微生物活性下降.
土壤養分礦化能力和速率也隨之降低,導致土壤較貧瘠.在海拔高度4 200m以上的農田中,青稞是唯一種植的作物,是藏族群眾的基本口糧來源,也是西藏地區最具特色的原料作物.因此用微生物菌肥改善當地土壤肥力條件,提高青稞的產量和質量,是維持當地經濟社會健康發展的重要保障.
目前有關外來微生物菌劑對根際微生態的研究主要集中在解磷解鉀菌、固氮菌及其他PGPR促生菌方面,且大多是采用傳統方法,如菌落計數法等,來研究對土壤和植物的施用效果.
變性梯度凝膠電泳\\(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE\\)技術可快速從土壤中提取微生物DNA片段,揭示所研究土壤的微生物群落結構特征,該技術在分析外源物質對土壤細菌群落多樣性的影響和種群動態監測方面得到廣泛使用.
本研究以西藏地區廣泛存在的棕色沙壤土為研究對象,在施用微生物菌肥后采用PCR-DGGE技術檢測微生物菌肥對土壤微生態中細菌群落多樣性的影響,研究微生物菌肥對西藏土壤微生物的影響,以期探討微生物肥料的作用機理,并初步探究采用綜合分析指標評價微生物肥料肥效的可行性.
1 材料與方法
1.1 試驗地概況
試驗地為西藏自治區農業研究所4號試驗地,位于西藏自治區東南部拉薩市雅魯藏布江支流拉薩河中游,主要地貌為河谷平原,91°02′E,29°38′N,屬高原山地氣候,海拔3 650m,年均溫7.4 ℃,年降雨量500mm,降雨集中于6,7,8,9月份,多夜雨.
1.2 試驗材料
供試青稞品種為藏青320,由西藏自治區農業研究所制種.供試土壤為河谷農區棕色砂壤土,基礎理化性質:全氮0.98g/kg、全磷1.72g/kg、全鉀5.49g/kg、堿解氮113.05mg/kg、有效磷17.86mg/kg、速效鉀31.63mg/kg、有機質13.58mg/kg、pH值7.72.供試菌劑為谷特菌肥,購買自禾康肥料有限公司,菌肥配置方法為砂糖100g,黃豆粉100g,谷特菌0.25g,1000mL水.
1.3 試驗設計
試驗設12個處理,小區面積50m2,3次重復,施肥方式為化肥+菌肥,分根施\\(播種前將菌肥稀釋后直接施于土壤中\\)和葉面噴施\\(三葉期后將菌肥稀釋后均勻噴灑到青稞葉面上\\)兩種.
化肥的施用量為磷酸二銨0.5kg/hm2,尿素0.33kg/hm2,氯化鉀0.1kg/hm2,各處理間化肥施用量保持一致,不同處理的谷特菌肥的施用量見表1-a,b.種植時間為2011年5月初,種植期間施肥、灌溉、中耕除草等統一管理.【表1】
青稞收獲后,在試驗小區內用土鉆“S”形隨機選擇5個點,采樣深度為0~20cm,除去可見動植物殘體及小石塊后混勻.用于測定土壤微生物量的土壤樣品保存在4 ℃冰箱中.用于PCR-DGGE分析的樣品迅速凍存于-20℃冰箱,以進行分子生物學實驗.
1.4 測定項目及方法
1.4.1 土壤中可培養真菌、放線菌數量及微生物量氮的測定土壤中可培養真菌及放線菌的分離和數量測定采用稀釋平板法,培養基分別為葡萄糖酵母膏培養基及高氏1號培養基.微生物量氮測定采用氯仿熏蒸提取法.
1.4.2 細菌基因組 DNA 的提取及PCR擴增
1\\)稱取0.5g土樣,用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA Kit D5625-01提取DNA,得到的DNA用1%瓊脂糖電泳檢測,并用紫外分光光度計測定其濃度和純度.由于土壤中含有腐殖酸,影響DNA的擴增,本研究采用稀釋20倍的土壤DNA進行擴增.
2\\)將基因組DNA作為PCR的模板,采用細菌16SrRNA的V3區特異性引物對F338-GC和R518進行PCR擴增.它們的序列分別為338F-GC\\(5\ue10b-GC-clamp-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG -3\ue10b\\)和518R\\(5\ue10b-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3\ue10b\\).GC夾序列為:CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGGGCG GGG GCA CGG GGG G\\)\\(由英濰捷基\\(上海\\)貿易有限公司合成\\),擴增產物片段長約200bp.
3\\)50μL PCR反應體系組成如下:TakaRaTaq\\(5U/μL\\)0.25μL、10×PCR Buffer\\(Mg2+\\)5μL、MgCl2\\(25mmol/L\\)3μL、dNTP Mixture\\(各2.5mmol/L\\)4μL、模板為20倍稀釋的總DNA\\(100μg/mL\\)2μL、引物1\\(20μL\\)1μL、引物2\\(20μL\\)1μL,無菌純水補齊到50μL.
4\\)PCR反應條件:采用普通PCR,即預變性95℃3min,32個PCR循環為94℃30s,53℃30s和72℃30s,最后在72℃下延伸10min.PCR反應的產物用1.8%瓊脂糖電泳檢測.
1.4.3 PCR反應產物的變性梯度凝膠電泳\\(DGGE\\)分析采用Bio-Rad公司DcodeT M的基因突變檢測系統對PCR反應產物進行分離.
1\\)雙梯度變性膠的制備:使用梯度混合裝置,制備8%的聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度從35%\\(16.8gurea;16mL formamide/100mL Denaturant\\)到60%\\(25.2g urea;24mL formamide/100mL Denatur-ant\\),其中變性劑和丙烯酰胺的濃度從膠的上方向下方依次遞增.
2\\)PCR樣品的加樣:待變性梯度膠完全凝固后,將膠板放入裝有電泳緩沖液的電泳槽中,取PCR樣品30μL和6*loading buffer混合后加入上樣孔.
3\\)電泳、染色及拍照在70V的電壓下,60℃電泳14h.電泳結束后,將凝膠進行SYBR Green I避光染色后拍照.
1.4.4 特征條帶的回收與測序將DGGE凝膠上不同處理的優勢條帶用無菌、潔凈的刀片切下,放入1.5mL滅菌的離心管中,加入50μL去離子水,于4℃浸泡過夜.
次日,取1μL上清液為模板,以不加GC夾的引物,按照1.3.4中的PCR反應體系和程序再次擴增,擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,利用Biospin膠回收試劑盒回收目的條帶.
膠回收產物經pMD20-T載體連接,轉化E.coliDH5α感受態細胞,在含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB培養基上選擇白色克隆子,采用T載體通用引物進行菌落PCR檢測,將菌液送至上海英駿生物技術有限公司測序.
1.5 數據分析
1\\)土壤理化性質數據采用Excel2007進行標準化處理,應用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行方差分析,5%水平下LSD多重比較各處理平均值之間的差異顯著性.
2\\)用Bio-Rad公司的凝膠定量軟件Quantity One 4.6.2分析DGGE指紋圖譜中微生物群落結構,計算土壤中細菌的Shannon多樣性指數\\(H\\)、豐富度\\(S\\)和聚類分析,其中聚類分析用UPGMA方法.【1】
式中:H表示Shannon-Weiner多樣性指數;ni是菌種i條帶的亮度;N是該泳道中所有條帶的總亮度.H值越大代表的物種多樣性越高.S表示物種種數.采用NCBI數據庫進行Blast分析,采用MEGA 4.0中的NEIGHBOR-JOINING程序進行細菌聚類分析并構建系統進化樹.
2 結果與分析
2.1 菌肥對土壤中可培養真菌、放線菌數量及微生物量氮的影響土壤中可培養放線菌與真菌數量以及兩者之間的比例是反映土壤微生物區系的常用指標.
從表2可以看出,分別施入不同量菌肥,除G7和Y3\\(即根施23.3mL/hm2和葉面噴施40.0mL/hm2,分別是兩種施肥方式的最高施肥量處理\\)外,與對照相比,施肥處理顯著降低了土壤中的真菌數量\\(p<0.05\\),顯著增加了土壤中的放線菌數量\\(p<0.05\\).
例如,根施菌肥處理土壤放線菌數量較對照分別提高的幅度為115.43%~485.49%,其中根施23.3mL/hm2提高幅度最低,根施20.0mL/hm2處理最高;葉施菌肥處理土壤放線菌數量較對照增長率分別為899.23%,1630.06%和994.80%,以葉施26.7mL/hm2提高最多;谷特菌肥包括的有益微生物主要是放線菌.
上述結果表明施用微生物菌肥可以在很大程度上改變土壤微生物區系.
根施和葉面噴施放線菌增加最多的處理并不是施肥量最多的處理,而是僅次于最高施肥量的處理,這可能是由于在相同土壤條件下,過量菌肥微生物的施入導致營養不足,無法滿足施入微生物的繁殖需求.
施用菌肥青稞根際土壤中A/F值較對照增加,最大值出現在根施菌肥量10.0mL/hm2和13.3mL/hm2處理,根施A/F值整體上大于葉面噴施.
土壤微生物量是土壤有機庫中的活性部分,是土壤生態系統肥力的重要生物學指標.施肥處理土壤微生物量氮整體上較對照高,根施菌肥量16.7mL/hm2和葉施菌肥量26.7mL/hm2微生物量氮含量較對照分別提高114.59%和38.86%.同時表明根施對土壤微生物區系的影響高于葉面噴施.【表2】
2.2 土壤細菌的DGGE圖譜分析
2.2.1 基因組 DNA 的PCR擴增
在進行了土壤養分和微生物指標分析后,本研究試圖從分子生物學角度深入地了解菌肥對土壤細菌生物多樣性的影響.以等量的基因組DNA為摸板,以細菌的16SrDNA的V3區通用引物\\(338F-GC/518R\\)對每一樣品的基因組DNA進行體外擴增,結果顯示所用樣品均擴增出單一的目的條帶,得到的目的片段長度約200bp左右,是16SrDNA V3區的特異性片段,可以用于后續的環境樣本多樣性分析.
2.2.2 根施和葉面噴施不同菌肥施用量土壤細菌的遺傳變異
土壤中細菌群落DGGE結果如圖1所示.不同菌肥施用方式以及不同施用濃度的土壤樣品的帶型和條帶數目有一定差別.各處理的條帶數目、部分特異條帶的寬度與著色深度比較,大致表現出根施高于葉面噴施的趨勢,且根施對照Gck高于根施其他處理、葉面噴施對照Yck高于葉面噴施其他處理,說明菌肥的施用的確對根際微生態產生了影響,且根施和葉面噴施兩種方式對土壤表層細菌數量和群落結構的影響存在差異.條帶1,2,13和15存在于所有處理土壤中,且條帶亮度較高,表明該條帶所代表的微生物是土著種類和優勢菌種,對環境有很好的適應性.
條帶3,6,8,10,11和14來自土著細菌,菌肥施用量3.3mL/hm2時它們的灰度已明顯降低,隨菌肥施用量的增加逐漸減弱或消失,表明菌肥中以放線菌為主的微生物影響了這些條帶所代表的土著細菌的存活.
條帶4首次出現在對照Gck中,隨著菌肥施用量的增加條帶4消失,但菌肥施用量達到23.3mL/hm2時條帶4又再次出現,表明該微生物為土著細菌,來自菌肥的放線菌大量滋生時抑制了該菌的存活,23.3mL/hm2施菌肥處理放線菌較對照增量最低,條帶4細菌得以滋生;條帶16存在于菌肥施用量3.3~13.3mL/hm2之間,表明該微生物來自菌肥;條帶5,7和9為葉面噴施處理獨有,在噴施濃度為26.7mL/hm2時出現,該處理也是葉面噴施處理中放線菌增加最多處理,表明該濃度下菌肥微生物得到較充分的繁殖條件.
2.2.3 不同處理對根際細菌群落結構多樣性的影響和聚類分析
根施和葉面噴施不同濃度菌肥處理的細菌群落結構多樣性指數\\(H\\)和條帶豐富度\\(S\\)如表3所示.在兩種施用方式中,H和S均表現為根施高于葉面噴施.
根施處理中,對照Gck的DNA條帶數量最多,條帶亮度最高\\(如條帶6和條帶8\\),且Shannon多樣性指數最高.
隨著菌肥濃度的增加至13.3mL/hm2,條帶信號強度、多樣性逐漸下降,如Gck多樣性指數比G2,G4的分別高3.0%和3.6%.但當濃度升高至23.3mL/hm2\\(G7\\)時,其條帶數量和多樣性增加,與對照Gck的相當.該結果與土壤放線菌和真菌數量結果相似,即來自菌肥的放線菌大量滋生抑制土壤細菌多樣性.葉面噴施處理中,處理與對照的條帶數量和多樣性處理間差異不大.【表3】
為進一步了解不同施肥方式和施肥濃度對土壤細菌群落結構的影響,用UPGMA法進行聚類分析,結果如圖2所示.兩種施用方式土壤細菌DGGE圖譜明顯地分為兩大族群,7個根施處理聚為一簇,組間相似度最低為0.82,并進一步和對照Gck聚為一簇.其中特別是G2和G3處理,相似性系數高達0.91.葉面噴施的Y1,Y2和Y3聚為一簇,處理組與對照間差異較大.說明菌肥的施肥方式對土壤細菌群落結構的影響大于菌肥施用量對其的影響.【圖2】
2.2.4 序列測定和分析
根據DGGE指紋圖譜將各處理中共16條特征條帶切膠回收,其中條帶16未成功克隆,因此共獲得15條序列,在其他研究中也有類似現象發生.
如圖2所示,將15條帶的16SrDNA進行序列測定,獲得的序列通過NCBI數據庫的BLAST程序與GenBank數據庫中已報道的16SrDNA序列進行相似性比對分析.
結果表明,15條所測序列的最相似序列有4條來自GenBank數據庫中未培養的微生物克隆,其余的來自可培養微生物\\(表4\\),所測序列與數據庫中的16SrDNA序列擁有較高的相似性\\(≥97%\\).用這些序列與本實驗所得的序列構建進化樹,結果如圖4所示.
系統進化樹顯示,15個克隆分屬5個門:變形菌門\\(Proteobacteria\\)、放線菌門\\(Actinobacteria\\)、藍細菌門\\(Cyanobacteria\\)、厚壁菌門\\(Firmicutes\\)和酸桿菌門\\(Acidobacteria\\).其中變形細菌、藍細菌和厚壁菌是優勢菌,且是土壤中普遍存在的菌群.部分放線菌來源于菌肥,如條帶5和條帶9.
根施方式中,與對照相比,菌肥的施用對酸桿菌\\(Acidobacteria,條帶10\\)、放線菌\\(Actinobacteria,條帶12\\)和芽胞桿 菌 \\(Bacillus,條 帶13\\)等 土 著 菌 的 生 長 產 生 了 促 進 作 用.菌 肥 對 土 著 的 芽 單 胞 菌 屬 \\(Blasto-monasstrain,條帶3\\)、不可培養的根瘤菌屬\\(Uncultured Rhizobium,條帶4\\)和藍細菌\\(Cyanobacterium,條帶6\\)表現出抑制作用,其中條帶4在菌肥施用量為23.3mL/hm2時才再次出現.
根瘤菌屬菌株具有固氮作用,可以增加土壤含氮量.葉面噴施方式中,與對照相比,處理Y2引入了放線菌\\(Actinobacte-ria,條帶5和條帶9\\)以及變形菌\\(Proteobacteria,條帶7\\),噴施濃度為26.7mL/hm2有利于這3種菌的生長.
3 討論
本文采用了傳統的純培養方法結合DGGE技術,研究了菌肥對青稞種植土壤中微生物群落的動態變化.一些能夠分泌抗生素的土壤微生物能夠影響植物根際微生物群體的數量和組成.薛泉宏研究組運用傳統純培養方法研究用放線菌制劑處理人參、西瓜等,發現土壤中放線菌的數量和比例顯著增加,真菌的數量和比例減少.Khaled A.等研究發現非鏈霉素放線菌同樣可以抑制土壤中真菌的生長,促進植物的生長.
本研究中,施用菌肥后,土壤中放線菌數量顯著增加,增加幅度先快后慢;真菌數量顯著降低,且真菌降低速度先快后慢,反映了谷特菌肥中放線菌與土壤真菌的拮抗和競爭營養的關系.PCR-DGGE技術是研究環境樣品非\\(難\\)培養微生物的有效方法.國內外的研究表明,施加外源微生物菌劑可以改變植物根際土著微生物類群.
本研究DGGE圖譜分析表明,施入適宜量菌肥施入后,菌肥微生物能夠利用土壤有機無機養分迅速繁殖,本研究谷特菌肥為放線菌劑,菌肥中的放線菌產生抗生素及其競爭養分的能力抑制了真菌和細菌的生長繁殖,因而降低了土壤細菌的多樣性.過量菌肥施入后,土壤有限的養分不再滿足菌肥微生物大量生長的需要,表現為青稞土壤細菌的多樣性緩慢升高,放線菌菌數量增加有限.所以本研究充分說明菌肥的施用量必須適宜,過多除造成不要的浪費,還影響其對土壤微生物的區系效果的發揮.所以使用DGGE測定土壤細菌多樣性可以準確反映菌肥微生物繁殖和發揮作用的狀況.
本研究中,根施最佳菌肥施用量為20.0mL/hm2\\(G6處理\\),G6處理的放線菌數量、A/F、微生物量氮和香農多樣性指數均處于較高水平,葉面噴施最佳菌肥施用量為26.7mL/hm2\\(Y2處理\\),其放線菌數量和微生物量氮均顯著高于其他處理.不同施肥方式對土壤微生物的影響不同,會導致土壤微生物多樣性的系統變化,根施和葉面噴施兩種施肥方式對土壤微生物的影響不同,大體表現為根施高于葉面噴施.
放線菌數量和A/F最大值均出現在根施處理,且根施處理對微生物量氮的提高率是葉面噴施處理的2.95倍,根施的著色深度及亮度明顯高于葉面噴施,兩種施肥方式的表層土壤Shannon多樣性指數和豐富度指數也表現為根施高于葉面噴施.傳統實驗室培養鑒定的微生物種類數量不到其總數的1%.與傳統方法相比,DGGE技術簡單、快速、準確,避開了傳統方法中微生物的富集培養,可以對復雜環境進行實時監測.
目前對西藏土壤微生物群落的研究還處于起步階段.在常規土壤養分、土壤微生物分析結果的基礎上,運用PCR-DGGE技術可以從微生物的角度揭示其多樣性,進而準確揭示菌肥對青稞種植土壤微生態的影響.
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