油棕\\(Elaeisguineensis\\)俗稱油椰子,屬棕櫚科椰子亞科油棕屬,是熱帶多年生單子葉木本油料作物。油棕平均年產棕櫚油4.17t/hm2,一些高油品種年產量可達16t/hm2,是其他油料作物\\(油菜、大豆、花生\\)年平均單產的6~20倍,是世界上生產效率最高的產油植物,被人們譽為“世界油王”[1]。

成熟的油棕果呈棕紅色,其中含有大量的類胡蘿卜素[1-2]。葉黃素\\(lutein\\)、番茄紅素\\(lycopene\\)、α-胡蘿卜素\\(α-carotene\\)和β-胡蘿卜素\\(β-carotene\\)是油棕果中含量最為豐富的類胡蘿卜素,其中80%為α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素[3]。類胡蘿卜素具有清除自由基、增強免疫力、降低癌癥發生幾率等作用[4],成為目前人們研究的熱點。高效液相色譜法是目前最有效的對植物果實中類胡蘿卜素進行定量和定性分析的分析方法[5-6]。Mortensen等[7-8]用C30色譜柱對粗提棕櫚油進行分析,結果表明40%的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素主要以順式異構體的形式存在。目前,對油棕果的研究主要集中在棕櫚油含量和成分,有關不同成熟期油棕果類胡蘿卜素種類與含量及其變化規律的報道較少[6,9]
。因此,筆者采用高效液相色譜法對不同成熟期油棕果中類胡蘿卜素含量進行檢測分析,考察油棕果發育過程中類胡蘿卜素含量的變化規律,以期探索類胡蘿卜素的積累與轉化規律,為進一步理解油棕果實類胡蘿卜素,特別是α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的積累機制、油棕的種植及保健食品及藥物開發提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2012—2013年在海南大學材料與化工學院重點實驗室進行。油棕果實采自中國熱帶農業科學院椰子研究所,采摘方法參照文獻[10]進行。5個不同發育時期分別命名為G1、G2、G3、G4、G5,其中G1、G2、G3、G4、G5分別為授粉后約10、45、90、135、180d[11]。新鮮油棕果采摘后―70℃保存備用。

儀器主要有美國Waters2695高效液相色譜儀、2487紫外檢測器、CR-22GⅡ日立離心機、分度吸量管、梨形分液漏斗等。β-胡蘿卜素標準品\\(分析標準品\\)、α-胡蘿卜素標準品\\(分析標準品\\)、蕃茄紅素標準品\\(純度98%\\)、葉黃素標準品\\(純度90%\\)均購于上海源葉生物科技有限公司。丙酮\\(分析純\\)、三氯甲烷\\(分析純\\)均購于天津市化學試劑一廠。乙腈、甲醇、二氯甲烷均購于Sigma公司進口分裝色譜級試劑;無水硫酸鈉、氯化鈉均購于廣州化學試劑廠分析純試劑。試驗用水為去離子三重蒸水。

1.2試驗方法

1\\)油棕類胡蘿卜素的制備。取冷凍保藏的不同時期油棕果解凍后,用蒸餾水洗凈,用小刀切下油棕果肉,稱取10g放到研缽里,加入20mL丙酮研磨成勻漿,倒入離心管,再加入10mL氯仿繼續研磨成勻漿,倒入離心管中,最后用10mL10%NaCl溶液洗滌研缽,合并濾液和果漿,并用玻璃棒攪拌混勻,在15℃8000r/min離心20min,收集濾液和氯仿相轉入有蓋試管中,殘渣和油棕果漿加5mL氯仿提取,重復2次直至果肉漿無色,再次15℃8000r/min離心20min,合并2次濾液和氯仿相,15℃8000r/min離心20min。將濾液轉入梨形分液漏斗,靜置30min,分層后用50mL三角瓶收集下層\\(氯仿相\\),再加入10mL氯仿到梨形分液漏斗進行萃取,并充分振搖,靜置10min,完全分層后,收集下層\\(氯仿相\\),棄去上層\\(水相\\),最后在50mL三角瓶加入適量的無水硫酸鈉遮光干燥30min。

2\\)不同成熟期油棕果中類胡蘿卜素的測定。

①標準品的配制。分別稱取一定量β-胡蘿卜素標準品、蕃茄紅素標準品、葉黃素標準品用色譜級流動相定容至50mL,分別配成308、10、272μg/mL。分別取β-胡蘿卜素標準品溶液、蕃茄紅素標準品溶液、葉黃素標準品溶液1、2、1mL混勻\\(其質量濃度分別為β-胡蘿卜素標準品77μg/mL、蕃茄紅素標準品5μg/mL、葉黃素標準品68μg/mL\\),根據高效液相色譜圖,測出相應物質的峰面積。

②樣品的配制。將提取液溶于色譜級流動相條件\\(V乙腈∶V甲醇∶V樣液=50∶15∶35\\),定容至100mL,即不同時期油棕果中類胡蘿卜素高效色譜法的樣液。

③色譜條件。高效液相色譜檢測器為二極管陣列檢測器\\(PAD\\),色譜柱:X-BridgeC18\\(250mm×4.6mm,粒徑5μm\\);流動相為V乙腈∶V甲醇∶V二氯甲烷=85∶13∶2;流速1.0mL/min;柱溫30℃,取10μL油棕類胡蘿卜素提取液進樣;450nm波長處檢測。記錄保留時間及各組分的光譜圖與標品對照定性。

1.3統計分析

對HPLC得到的色譜圖,用島津公司的Class-vp軟件轉化為峰面積,按外標法定量。用Excel進行方差分析。

2 結果與分析

2.1不同成熟期油棕果類胡蘿卜素高效液相色譜

1\\)標準品高效液相色譜圖。葉黃素標準品、蕃茄紅素標準品和β-胡蘿卜素標準品溶液混合后高效液相色譜見圖1。3種物質主峰保留時間分別為3.233、13.871和25.902min,按質量濃度分別為68、5和77μg/mL上樣,對應的峰面積分別是25439、20839和117369。

2\\)不同成熟期類胡蘿卜素高效液相色譜圖。5個發育時期油棕果按本文“1.2.1\\)”樣品處理方法,在選定的液相色譜條件下進樣,測定其主要的類胡蘿卜素物質與含量\\(圖2\\)。5個時期均能獲得類胡蘿卜素各組分良好的分離效果。根據葉黃素、蕃茄紅素和β-胡蘿卜素3種標準品的保留時間,得到這3種物質在5個時期中的主峰,除了G2時期未能檢測到番茄紅素外,其他時期均有該類物質。經過計算,分別得到各物質的絕對含量和相對含量\\(表1\\)。由于α-胡蘿卜素標樣難以制備和購得,根據文獻[12]中α-胡蘿卜素在選定的液相色譜條件下的保留時間,推斷出油棕果類胡蘿卜素HPLC譜圖中α-胡蘿卜素的主峰。在5個時期中α-胡蘿卜素主峰的出峰時間均在21.129~23.030之間\\(圖2\\)。

除此之外,5個時期均發現其他類胡蘿卜素物質。每個時期的峰數不盡相同。有意思的是,G1-G3時期HPLC譜圖形相似;而G4和G5時期HPLC譜圖形相似。G1-G3時期HPLC譜圖中,峰數主要集中在出峰時間較早的位置,且隨著成熟時期增加而峰數逐漸減少。

2.2不同成熟期油棕果類胡蘿卜素主要組分含量的變化

根據3次HPLC譜圖中葉黃素、番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素4種主要組分的含量,取平均值\\(表2\\)。油棕果中葉黃素的含量呈現逐漸減少的變化趨勢。

G1時期含量最高,在前3個時期\\(G1-G3\\)持續較高表達;G4時期開始明顯下降,至G5時期,含量變化不大。番茄紅素的變化沒有表現出線性化的規律。除了G2時期未檢測到番茄紅素外,其他4個時期均有,其中G4時期最高;其次為G1和G5,含量減少了約1/3。作為類胡蘿卜素最重要的成分之一,α-胡蘿卜素在油棕果中含量變化相當明顯。前3個時期其含量都在100μg/g左右,后2個時期則迅猛升高,到G5時期,含量達10000μg/g。

β-胡蘿卜素在油棕果中的含量變化與α-胡蘿卜素非常相似,G1-G3含量較低,變化不大,G4和G5時期含量陡然增加,在G5時期達到最高值。

3討論

類胡蘿卜素提取的充分和溶解狀態,直接影響后續HPLC分析效果,影響組分的分離和獲得。類胡蘿卜素種類繁多,它們之間極性差異較大,提取分離過程中多易降解,使得類胡蘿卜素的提取采用單一有機溶劑提取通常不能達到良好的效果。目前,油棕果類胡蘿卜素提取分離方法未見報道。為了能獲得更多的分離組分,我們分別采用6種不同有機溶劑配比的提取方法,提取液進行HPLC檢測,摸索建立針對油棕果中類胡蘿卜素的分離技術。第1種用V乙酸乙酯∶V丙酮=1∶1,可從不同成熟期油棕果中可分離出6種組分;第2種采用V丙酮∶V乙酸乙酯∶V乙醇=1∶1∶1混合液,可分離出5種類胡蘿卜素;第3種則用V乙酸乙酯∶V丙酮=2∶1混合液和10%NaCl,可獲得出8種組分;第4種為V正己烷∶V丙酮=2∶1混合液可分離出11種組分;第5種為V乙酸乙酯∶V丙酮=1∶2,混合液和2mL6%KOH-甲醇溶液皂化,雖可有效除去葉綠素和油脂類物質,將類胡蘿卜素酯水解成為游離態的類胡蘿卜素,但皂化會造成類胡蘿卜素總含量和單個類胡蘿卜素組分不同程度的損失,同時這些物質還會影響色譜的分離,縮短色譜柱的壽命;第6種用丙酮、氯仿和10%NaCl分別處理,可從油棕果中分離出大約18種組分。由此可見,第6種提取方法有望獲得較豐富的類胡蘿卜素分離組分。

由圖2A-E的峰型可看,油棕類胡蘿卜素各物質其含量在5個時期的發育過程中有2個明顯的分界:G1-G3;G4-G5。

G1-G3中,主要存在是極性大的物質,且極性程度接近。

G4-G5中,極性較大的物質含量極少,極性較小的物質均勻分布。分析5個時期類胡蘿卜素主要組分的總峰高和總峰面積,可推斷類胡蘿卜素總含量?？梢?從G1到G5,類胡蘿卜素總含量上升,尤其是G4期之后。對葉黃素、蕃茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素含量變化進行分析后發現,與其他極性較大的物質含量變化相一致,葉黃素的含量隨著油棕成熟度的增加而減少,而蕃茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素含量逐漸增加。極性居中的蕃茄紅素的變化不是很明顯,極性相對較小的α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素的含量急劇上升。油棕果發育過程包含了前期細胞快速增殖和后期脂肪積累兩個過程。由此可見,在前期極性大的物質參與了細胞快速增長過程,這一過程脂肪積累相當少。待細胞發育到一定大小,果實內部才逐漸開始調控脂肪的堆積。在后期\\(G4和G5\\)脂肪堆積過程中,類胡蘿卜素在酶的作用下不斷轉化為以α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素,特別是β-胡蘿卜素\\(大約是α-胡蘿卜素的3~4倍\\)為主要形式。

β-胡蘿卜素占成熟期類胡蘿卜素總量的60%以上,這也是成熟油棕果外在特征\\(橙紅色\\)的體現。油棕果成熟過程中類胡蘿卜素的變化主要是β-胡蘿卜素的積累過程。