番茄（Solanum lycopersicum L.）生產中番茄黃化曲葉病毒為害日趨嚴重（Czosnek & Ghanim，2011）。番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus）簡稱 TYLCV，是單鏈環狀 DNA 病毒（劉玉樂 等，1998），主要依靠煙粉虱進行傳播（Stansly et al.，2012）。與傳統育種相比，基因工程育種周期短，在育種過程中不會帶入其他不良農藝性狀的基因，在番茄抗病毒病育種中的應用日益受到重視。通過克隆與抗 TYLCV 有關的基因導入植物體內，有望提高植物的抗病性。

研究表明，R 基因對各種病原菌引發的病害均具有抗性，且在植物基因組中分布廣泛（Flor，1971）。根據已克隆的 R 基因所編碼的蛋白質保守結構及其在細胞中的位置，可以將 R 基因分為NBS-LRR 類、LRR-TM 類、STK 類、LRR-TM-STK 類和 CC 類抗病基因（Hammond-Kosack & Jones，1997）。NBS-LRR 類基因是已知的 R 基因家族中最大的一類（Dangl & Jones，2001）。比較基因組分析表明植物基因組可以編碼數十個到數百個 NBS-LRR 基因，如木瓜和黃瓜的 NBS-LRR 基因有50 個，而水稻則多達 653 個（Shang et al.，2009）。在病毒侵染時，NBS-LRR 基因驅動植物表型反應，以過敏性抗性反應和極端抗性反應兩種形式抵御病毒侵染（Hull，2002），且在極端抗性中病毒增殖被限制在單細胞水平，通過局部壞死病變使病毒不能在初始侵染位點擴增（Lukhovitskaya et al.，2005）。NBS-LRR 基因編碼的 NBS-LRR 蛋白具有核苷酸結合位點（NBS）和富亮氨酸重復基序（LRR），其中 NBS 包含在信號轉導中，具有高度保守且嚴格有序的多個功能基序（Tan &Wu，2012），LRR 為高度靈活的結構域，可能作為受體參與病原體的識別和信號轉導，其激酶結構域在激活其下游轉導元件中發揮作用（Jones & Dangl，2006）。目前已知 LRR 結構域通過調控 NBS 結構域的分子狀態來發揮抗病功能（Takken et al.，2006）。

基于番茄響應 TYLCV 侵染的轉錄組結果，作者前期發現了 1 個 NBS-LRR 類抗病基因在抗病番茄材料中上調表達，并通過 VIGS 和在 TYLCV 侵染抗病番茄材料‘CLN2777A’后該基因表達量的變化表明該基因有一定的抗病功能（Chen et al.，2013）。本試驗中進一步克隆該 NBS-LRR 類抗病基因 ClNLR，通過熒光定量 PCR 發現 ClNLR 在番茄‘CLN2777A’根和葉片中高水平表達，且通過抗、感番茄材料接種 TYLCV 后 ClNLR 表達量的對比和在本氏煙中的瞬時表達，進一步證明了該基因與番茄抗病性相關。同時再次通過 VIGS 試驗對接病前后番茄抗病材料‘CLN2777A’的表型進行了觀察，并通過熒光定量 PCR 驗證了前期的試驗結果。

1、 材料與方法

1.1 試驗材料

抗 TYLCV 番茄材料‘CLN2777A’和感 TYLCV 番茄材料‘TMXA48-4-0’由江蘇省農業科學院蔬菜研究所提供。攜帶TYLCV的煙粉虱為連續飼養于防蟲溫室番茄上的試驗種群。pTRV1、pTRV2和 pTRV2-PDS 質粒由清華大學劉玉樂教授饋贈。大腸桿菌 DH5α、根瘤農桿菌 LBA4404、GV3101、質粒 pBI121 均為本實驗室保存。表達載體質粒 CaMV35S 由本實驗室在 pBI121 的基礎上改造而成。

TA 克隆載體 PGEM-T 載體、限制性內切酶（XbaⅠ、BamHⅠ、SacⅠ）、T4DNA 連接酶、DNA 聚合酶、DNA 分子量標準均購自 TaKaRa 公司，其他試劑為國產分析純試劑。TIANamp Genomic DNAKit、血液/細胞/組織基因組 DNA 提取試劑盒購自 TIANGEN 生物公司，質粒提取試劑盒、PCR 清潔試劑盒、DNA 片段快速純化/回收試劑盒購于 AXYGEN 公司。引物序列由 Primer 5.0 引物設計軟件評價生成，并委托上海英駿公司合成。

1.2 ClNLR 的克隆與序列分析

在前期的研究中，從‘CLN2777A’和‘TMXA48-4-0’番茄材料接種 TYLCV 前后的轉錄組（NCBIsra 數據庫登錄號 SRP028618）中發現 1 個響應 TYLCV 侵染而上調表達、注釋為含有 NBS-LRR 結構域的抗性基因Solyc05g009760.1，通過初步的功能驗證，表明該基因有一定的抗病功能（Chen et al.，2013）。

根據 Solyc05g009760.1 基因序列，用 Primer 5.0 軟件設計擴增基因編碼區全長的特異引物 P3：5′-TTCACAAGACTTTAGATGTGGCAT-3′及 P4：5′-AGTAGTTCTTGGGGATATGAAGTTG-3′，以抗病材料‘CLN2777A’cDNA 為模板，參照 PrimerSTAR 高保真酶反應體系擴增該基因序列。PCR 反應條件為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min 30 s，35 個循環；72 ℃ 10 min。

將回收的 PCR 產物連接至 PGEM-T 載體后轉化大腸桿菌 DH5α，轉化子經菌落 PCR 鑒定為陽性克隆后送至上海英駿公司測序。所獲得的基因序列命名為 ClNLR 基因。用在線軟件 Conserved Domains分析保守結構域。

1.3 ClNLR 在 TYLCV 誘導下的表達分析

將番茄材料‘CLN2777A’和‘TMXA48-4-0’以攜帶 TYLCV 的煙粉虱進行 TYLCV 接種 5 d后，提取葉片 RNA，M-MLV Reverse Transcriptas（eMBI 公司）反轉錄合成 cDNA。以 Actin（AB199316）為內參，熒光定量 PCR 檢測 ClNLR 基因的表達情況。ClNLR 和 Actin 引物分別為 ClNLR-forward：5′-CTTTGCGGGTTCGTTCATCTTAT-3′；ClNLR-reward：5′-CGTTTATGTCCACATGCCTCAAC-3′；Actin-forward：5′-TGGTCGGAATGGGACAGAAG-3′；Actin-reward：5′-CTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′。熒光定量 PCR 反應體系為 20 μL：2× SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ10 μL，引物各 1 μL，cDNA模板 1 μL，超純水 7 μL，混合加樣。PCR 反應程序為 96 ℃預變性 1 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 45 s，40 次循環。試驗設置 3 個生物重復。

1.4 ClNLR 的組織表達分析

提取番茄抗病材料‘CLN2777A’根、莖、葉片、花蕾和果實 RNA，每個樣品取 500 ng RNA，反轉錄成 cDNA 后稀釋 1 000 倍，取 2 μL 進行熒光定量 PCR 反應?；蛱禺愐?、內參引物、熒光定量 PCR 的反應體系和反應程序參照 1.3 的方法。試驗進行 3 個生物學重復。

1.5 ClNLR 在本氏煙的瞬時表達

以獲得的ClNLR 基因為模板，通過 PCR 擴增在ClNLR基因兩端引入BamHⅠ和SacⅠ酶切位點。PCR 引物為 P5：5′-CATGGATCCGGCATTGTTAATCATTAGAGTATG-3′（引入 BamHⅠ酶切位點）和 P6：5′-ACTGAGCTCTTAGTAGTTCTTGGGGATATGAAG-3′（引入 SacⅠ酶切位點）。植物表達載體 pBI121 和 PCR 產物分別經用 BamHⅠ和 SacⅠ雙酶切，于 16 ℃連接過夜。取 5 μL 連接產物轉化大腸桿菌 DH5α，在固體 LB（附加 50 mg · L-1卡那霉素）培養基上 37 ℃培養過夜，單克隆提取質粒 DNA 并經酶切驗證后命名為 pBI121-ClNLR。pBI121-ClNLR 質粒通過凍融法轉化農桿菌LBA4404。

將含有pBI121-ClNLR的農桿菌接種于液體LB（附加50 mg · L-1卡那霉素和25 mg · L-1利福平）、28 ℃培養過夜。取培養液離心棄上清，沉淀重懸于緩沖液（10 mmol · L-1MES，10 mmol · L-1MgCl2，200 μmol · L-1乙酰丁香酮）內，調整 OD600值至 0.5，用無針頭 1 mL 無菌注射器將農桿菌懸浮液壓入5 ~ 6片真葉期的本氏煙的半邊葉片，另一半邊葉片注射以同樣方法獲得的pBI121-GFP作為對照。

農桿菌注射后的煙草在培養箱中（22 ℃，75%空氣濕度，黑暗）培養 2 d，轉入人工氣候室培養（28 ℃，16 h/8 h 光照周期），觀察表型變化。

1.6 VIGS 沉默 ClNLR 基因

以pBI121-ClNLR為模板，PCR克隆出283 bp的ClNLR基因片段（P7：5′-GTATCTAGAGTGTTGTATGTCCGTGGCTGAC-3′和 P8：5′-CATGGATCCGAGAACCCAATGAC TCCCTGC-3′）。用 XbaⅠ和BamHⅠ酶切 PCR 產物和病毒載體 pTRV2，然后將該基因片段克隆至 pTRV2 中，構建 ClNLR 基因的沉默載體 pTRV2-ClNLR。

質粒 pTRV1、pTRV2、pTRV2-PDS 和 pTRV2-ClNLR 采用凍融法轉化農桿菌 GV3101。將轉化成功的農桿菌 28 ℃過夜培養，離心棄上清后重懸于緩沖液（10 mmol · L-1MES，10 mmol · L-1MgCl2，200 μmol · L-1乙酰丁香酮）中，調節 OD600值至 2.0，室溫放置 4 ~ 6 h 后，將含有 pTRV2-ClNLR、pTRV2-PDS 和 pTRV2 空載體的農桿菌懸浮液分別與含有 pTRV1 的農桿菌懸浮液按 1︰1 的比例混合，用無針頭 1 mL 無菌注射器將農桿菌懸浮液注入抗病番茄材料‘CLN2777A’子葉期幼苗的子葉中。其中，注射 pTRV1 + pTRV2 空載體的植株為陰性對照，注射 pTRV1 + pTRV2-PDS 的為陽性對照，番茄幼苗一直在 22 ~ 25 ℃、相對濕度 50%、16 h/8 h 的光照周期下生長。

當注射 pTRV1 + pTRV-PDS 的番茄葉片上出現光漂白現象時，提取 pTRV1 + pTRV2-ClNLR 的番茄上端嫩葉總 RNA；并用 oligo（dT）合成第一鏈 cDNA，然后通過熒光定量 PCR 檢測 ClNLR 基因的沉默效果，定量引物及反應條件參照 1.3。

1.7 ClNLR 基因沉默對番茄體內 TYLCV 含量的影響

選取 ClNLR 基因沉默的番茄植株和注射 pTRV1 + pTRV2 空載體的番茄植株同時置于密閉的防蟲溫室，煙粉虱接種 TYLCV 后 7 d 時，用 CTAB 法提取番茄葉片總 DNA。用 SHIMADZU 公司的BioSpec-nano/230v 型號的微量分光光度計測定總 DNA 濃度后，將其稀釋為終濃度 300 ng · μL-1備用。熒光定量 PCR 檢測番茄植株體內的 TYLCV 積累，以 Actin 為內參。其中檢測 TYLCV 病毒含量的引物為 TY-AV494：5′-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAG-3′和 TY-COPR：5′-GANGSATGHGTRCADGCCATATA-3′，Actin 引物及熒光定量 PCR 的反應條件參照 1.3。

2、 結果與分析

2.1 ClNLR 基因的克隆

作者前期通過比較番茄材料‘CLN2777A’和‘TMXA48-4-0’接種 TYLCV 前后的轉錄組（NCBIsra 數據庫登錄號 SRP028618），發現在接種 TYLCV 后，1 個 NBS-LRR 類抗性基因（Solyc05g009760.1）在抗病材料‘CLN2777A’中上調表達，而在感病材料‘TMXA48-4-0’中則無明顯變化（Chen et al.，2013）。

本試驗中進一步通過 PCR 克隆該基因，鑒于該基因的注釋功能為 NBS-LRR 抗病基因將之命名為 ClNLR。結構分析表明 ClNLR 基因編碼蛋白在 N 端第 43 ~ 323 位氨基酸為保守結構域 NB-ARC，480 ~721 位氨基酸序列為典型的 LRR 結構域（圖 1）。

2.2 ClNLR 基因的表達分析

為了驗證 ClNLR 基因的轉錄組表達結果，利用熒光定量 PCR 檢測 ClNLR 響應 TYLCV 侵染的表達情況?？共》巡牧稀瓹LN2777A’和感病番茄材料‘TMXA48-4-0’通過煙粉虱接種 TYLCV，5 d 后 ClNLR 在抗病材料中表達量相比接種前上調了約 12 倍，而在感病材料中則無明顯變化（圖 2），基因表達變化趨勢與轉錄組結果（Chen et al.，2013）基本一致。熒光定量 PCR 進一步檢測 ClNLR 基因在抗病番茄‘CLN2777A’中的組織表達情況，發現 ClNLR在根部表達最強，其次為葉片，在果實中表達最弱（圖 3）。

2.3 ClNLR 瞬時表達引起本氏煙過敏性反應

將含有 ClNLR 基因植物表達載體的農桿菌通過農桿菌浸潤法注射本氏煙葉片 15 d 后，注射 ClNLR 基因的一側葉片上出現了壞死斑，而注射 GFP 基因的另一側葉片沒有任何變化（圖 4），表明 ClNLR 基因誘導了本氏煙過敏性反應，可能與植物抗病防衛反應相關。

2.4 沉默 ClNLR 基因影響番茄 TYLCV 抗性

為了研究ClNLR在番茄中抗TYLCV的作用，本試驗中通過TRV沉默抗病番茄的ClNLR基因。番茄幼苗注射 TRV 沉默載體 15 ~ 20 d后，注射 pTRV1 + pTRV2-PDS 的陽性對照植株新葉出現光漂白現象，隨著時間推移，葉片出現光漂白現象愈明顯（圖 5），表明 VIGS 沉默成功。

此時提取 pTRV1 + pTRV2-ClNLR 處理的番茄嫩葉總 RNA，通過熒光定量 PCR 檢測發現 3 株獨立 VIGS 處理的番茄植株 ClNLR 基因的表達水平下降至陰性對照的 40% ~ 80%（圖 6）。這些 pTRV1 + pTRV2-ClNLR 處理的番茄通過煙粉虱接種 TYLCV 7 d 后，熒光定量 PCR 檢測發現抑制ClNLR基因表達可使番茄體內的TYLCV含量增加，且ClNLR基因表達水平與其體內TYLCV積累量成反比（圖 6，圖 7），但 ClNLR 基因表達下降的番茄植株接種后沒有出現典型的葉片黃化、卷曲等番茄黃化曲葉病病癥（圖 5），這可能是由于 CLNLR 的沉默效率未能達到使基因表達完全被抑制的水平，低表達的 ClNLR 仍能維持植株一定的抗性。

3、 討論

植物對病毒的抗性大概可以描述為基因網絡中基因的相互作用和信號傳遞途徑抑制了病毒的復制和移動，以及誘導產生的小分子介導了抗性基因的活化（Culver & Padmanabhan，2007）。抵抗TYLCV 的分子和生化機制仍不清楚（Gorovits et al.，2007），因此描繪 TYLCV 的抗性網絡并發掘抗性基因是至關重要的。為了達到這個目標，開展了番茄響應 TYLCV 侵染的轉錄組研究，還發現ClNLR 基因（Solyc05g009760.1）可能參與抵抗 TYLCV 侵染的防衛反應（Chen et al.，2013）。在此基礎上，本試驗中進一步克隆了該 ClNLR 基因（圖 1）。熒光定量 PCR 證實 ClNLR 基因在抗病番茄材料上調表達，而在感病材料中無明顯表達變化（圖 2），初步說明 ClNLR 基因在抗病番茄中可以響應 TYLCV 的侵染。ClNLR 基因在本氏煙葉片上的瞬時表達可產生過敏性反應（圖 4），VIGS 抑制抗病番茄材料 ClNLR 基因的表達提高了 TYLCV 在番茄葉片中的積累量，且番茄 ClNLR 基因表達水平與其體內 TYLCV 積累量成反比（圖 5、圖 6、圖 7），表明該基因可能參與了番茄抗 TYLCV 的防衛反應。ClNLR 基因在番茄的根和葉片中表達最高（圖 3），也可能與其抗病功能相關。

ClNLR 編碼的蛋白質含有 NBS-LRR 抗病蛋白的特征結構域，其 N 端為 1 個典型的 NB-ARC 結構域，C 端含有 4 個 LRR 保守結構域，是典型的 NBS-LRR 類抗病基因的結構（圖 1）。NBS 在細胞的生長與分化、小泡運輸、細胞骨架構成及防御反應中都具有重要作用（Pan et al.，2000）。NB-ARC結構域分布于真核生物的許多蛋白中，如 GTP 結合蛋白、ATP 合成酶 β 亞基、核糖體延伸因子（elongation factors）異質三聚體、R 基因編碼蛋白等且它在蛋白與蛋白互作中作為一個功能組件發揮作用，比如嘌呤核苷酸的結合通常被認為是改變了 R 蛋白與防御信號傳導途徑中其它成員間的相互作用（Bent，1996）。而具有特異識別的氨基酸殘基大部分位于 LRRs，可形成多種配基結合域作為 R 蛋白的受體區域，配基結合、參與蛋白與蛋白間的互作、蛋白與碳水化合物結合，并能特異性識別病原物來源的信號分子。在對擬南芥 NBS-LRR 類抗病基因 RPS5 的 LRR 突變體研究中發現，它不僅參與信號的識別還參與了下游信號的傳導（Wang et al.，1998）。根據 ClNLR 的結構特征，推測該基因可能通過與病原的效應子進行結合而抑制病原在植物細胞中定植和擴展，從而在番茄抗病防御過程中發揮作用。

在缺少相應 Avr 產物的情況下，有時候 R 基因的過表達也會引起 HR 反應。例如番茄的 Pto 基因（Tang et al.，1999），擬南芥的 RPS2 基因（Tao et al.，2000）和煙草的 L 基因（Frost et al.，2004）。

這些數據表明信號級聯反應可以在缺少病原物的情況下被激活。這種強烈的過敏性壞死反應在 R 蛋白 RPS2 和 RPS5 中通過 CC 區域和 NB-ARC 片段（CC-NB-ARC）誘導產生（Tao et al.，2000；Juleset al.，2007）。而在 RPS4 和 RPP1A 抗性蛋白中，TIR-NB-ARC 便足以誘導 HR（Zhang et al.，2004；Weaver et al.，2006）。ClNLR 編碼的蛋白不包含 TIR 和 CC 結構，哪個結構域引發了 HR 反應以及從 R 蛋白到 HR 免疫反應的信號轉導途徑仍有待進一步的研究。

病毒誘導的基因沉默已經發展為研究植物基因沉默的有效工具（Purkayastha & Dasgupta，2009）。

如今最常用的一種病毒載體為煙草脆裂病毒（Liu et al.，2002；Brigneti et al.，2004）。Czosnek 等（2013）通過比較抗感番茄材料的 cDNA 文庫和 VIGS 的方法，篩選并鑒定出 25 個在抗病番茄材料中優先表達的基因，其中 5 個基因的沉默使抗性瓦解，并指出番茄對 TYLCV 的抗性存在多層次關系，其中SlVRSLip 基因在 LEHT1 基因的下游發揮作用（Sade et al.，2013）。從圖 6 和圖 7 中可以看到，VIGS抑制 ClNLR 基因表達的 1、2 植株接種 TYLCV 后，帶毒量都顯著增加，植株 3 的 ClNLR 基因表達水平和接病后的帶毒量與對照相差不大，可能是由于該基因在植株 3 中沒有被有效沉默。值得注意的是，煙粉虱接種供試番茄植株后，即使顯著沉默的番茄也未出現番茄黃化曲葉病病癥，可能是由于ClNLR基因的沉默效率不高，未能使基因的表達被完全抑制或抑制到感病的水平，也可能是ClNLR基因只是抗病反應中的下游防衛基因并非抗病關鍵基因。通過接種其他病原物鑒定該基因是否具有廣譜抗性可以更好闡釋 ClNLR 基因在抗病反應中的作用。